Методы используемые для диагностики герпеса

Проблеме диагностики герпесвирусных инфекций посвящено множество научных публикаций, однако в последнее время все более возрастает интерес к этому вопросу со стороны клиницистов разных специальностей. По данным литературы, вирусом простого герпеса инфицировано 65-90 % взрослого и детского населения планеты. Местом локализации первичной герпесвирусной инфекции чаще всего является слизистая оболочка полости рта.

Несмотря на широкое и разностороннее изучение данной патологии, отмечается тенденция к росту распространенности герпетических стоматитов, особенно среди детского населения. Наделю герпетической инфекции среди всех поражений слизистой полости рта у детей приходится около 80 %, у 8-20% пациентов заболевание принимает рецидивирующий характер. При этом вирус может поражать практически все органы и ткани человеческого организма. У детей грудного и раннего возраста, после исчезновения антител, полученных интерплацентарно от матери, герпетическая инфекция, как правило,протекает в виде острого герпетического стоматита. Хроническая герпетическая инфекция в полости рта проявляется в виде рецидивирующего герпетического стоматитаили герпеса губ.

Современные наблюдения специалистов позволяют говорить о изменении клинической картины герпетического стоматита и выделении атипичных форм заболевания, а именно геморрагической, геморагически-некротической, язвенной, отечной, элефанзиазоподобной, рупеоидной, зудящей, эритематозной и папулезной, герпетиформной экземы Капоши, генерализованного герпеса. В литературе упоминается импетигоподобная форма герпеса, при которой высыпания на слизистой оболочке полости рта сочетаются со стрептококковым импетиго в периоральной зоне. Атипичные формы заболевания затрудняют диагностику. Таким образом, высокая инфицированность населения и распространенность заболевания, наличие атипичных форм и отсутствие четких диагностических алгоритмов свидетельствуют об актуальности этой проблемы.

Материалом для исследования при герпетической инфекции полости рта являются:

Соскоб и мазок-отпечаток с элементов поражения, слюна, кровь.

На сегодняшний день существует большое количество лабораторных методов диагностики герпесвирусных инфекций.

Выделяют три основных диагностических подхода:

1). изоляция и идентификация вирусаиз клинического материала;

2). непосредственное исследование материала на наличие вируса, вирусного антигена или нуклеиновых кислот

3). серологическая диагностика, основанная на установлении значительного прироста вирусных антител в течение болезни.

«Золотым стандартом» диагностики вирусных заболеваний является вирусологический метод. Сущность метода состоит в выделении вируса в культурах клеток и куриных эмбрионах. Достоинствами метода являются его высокая чувствительность (85-100%) и специфичность (100%). Однако метод является дорогостоящим, трудоемким, его проведение требует специального оборудования и условий, высокой квалификации персонала. Результаты вирусологического исследования получают через 2-20 дней, что препятствует внедрению метода в повседневную клиническую практику. Чувствительность метода зависит от времени, прошедшего с момента забора материала до посева, качества забора материала, условий транспортировки, качества используемых сред и реагентов. Вирусологическое исследование является практически бесполезным спустя 5 суток после появления элементов высыпания. Современные авторы указывают на необходимость подтверждения результатов вирусологического исследования другими методами, в частности серологическими и молекулярно-генетическими. Однако метод позволяет не только получить чистую культуру вируса, но и оценить его чувствительность к противовирусным препаратам.

В настоящее время применяется ускоренный вирусологический метод выявления вирусов. При этом методе материал, полученный от больных, культивируется совместно с культурой клеток Vero в течение 24-х часов. После предварительной обработки применяется реакция непрямой иммунофлюорисценциии результаты оценивают под люминисцентным микроскопом.Этот метод позволяет выбрать антивирусный препарат для лечения герпетической инфекции и оценить эффективность противовирусной терапии через 1,5-2 месяца после окончания лечения. Результаты обследования готовы через 2-е суток.

Биологическая проба состоит в заражении чувствительных лабораторных животных (белых мышей или кроликов) биоматериалом, полученным от больного. Метод рекомендуют использовать в спорных случаях герпесвирусной инфекции и для диагностики атипичных форм.

Вирусологические исследования нашли применение в стоматологической практике. Так, выделение вируса в культуре клеток и на мышахприменялось для оценки эффективности препарата «Виферон» при лечении острого герпетического стоматита у детей. Биологическая проба так же применялась для изучения течения герпетической инфекции под влиянием разных методов лечения в экспериментальном исследовании на морских свинках.

Микроскопические методы исследования герпеса:

включают цитологическую диагностику и электронную микроскопию. Исследуемый материал для микроскопических методов получают путем соскоба или мазка-отпечатка с пораженных участков слизистой и кожи.

Цитологический метод позволяет оценить морфологические, тинкториальные особенности клеток и их компонентов, определить стадию развития элементов поражения при герпетической инфекции. При исследовании препаратов-отпечатков с элементов поражения у пациентов с герпетическим стоматитом выделяют следующие морфологические стадии развития: дегенерации или типичных клеточных повреждений, дегенерации и неспецифического воспаления, регенерации, эпителизации. На стадии дегенерации или типичных поражений клетки под микроскопом нередко можно увидеть эпителиоциты с характерными признаками, которые определяют как клетки Тцанка. Цитологические изменения заключаются в формировании гигантских многоядерных клеток округлой или неправильной формы с цитоплазмой голубого или фиолетового цвета. Количество ядер в таких клетках – 2 и более. Гигантские многоядерные клетки являются патогномоничными для вирусных заболеваний кожи и слизистых оболочек. Их выявляют при простом герпесе, а так же кори, ветряной оспе, опоясывающем лишае и других вирусных поражениях.В некоторых случаях в гигантских многоядерных клетках определяются внутриядерные включения, которые многие авторы называют тельцами Каудри. E. V. Cowdry предложил разделить внутриядерные включения на два типа: А — характеризующиеся общей реакцией всего ядра при наличии одного крупного включения и В — при ограниченной реакции ядра, когда включения представляются в виде маленьких «капелек» в ядерной массе. Однако, по мнению автора, во многих случаях включения типа В лишь соответствуют определенной стадии образования включений типа А. Единого мнения в отношении природы этих образований не существует. Одни исследователи считают, что отмеченные включения являются случайными артефактами при применении кислых фиксаторов, другие считают внутриядерные включения Каудри типа А специфическим материалом, связанным с репродукцией вируса герпеса. По мнению этих исследователей, включения состоят из тонкого гранулярного материала с пучками фибриллярных структур, вирусных частиц, мембранных осколков. Гигантские многоядерные клетки выявляют при остройи хронической рецидивирующей инфекции. В то время как внутриядерные включения, по мнению некоторых авторов, определяются только при повторных поражениях.

Цитологический метод простой, доступный, рассматривается как экспресс-метод, так как результаты исследования получают через 2-3 часа. Его чувствительность и специфичность не превышают 70-75 %. Метод нашел широкое применение в стоматологической практикедля проведения дифференциальной диагностики в сложных случаях и оценки эффективности лечебных мероприятий.

К методам экспресс-диагностики герпеса относится:

Электронная микроскопия. Метод позволяет выявить вирусные частицы в исследуемом образце. Для успешного определения вируса его концентрация в пробе должна быть примерно 1ˑ10 6 частиц в 1 мл. Но поскольку концентрация возбудителя в материале обычно незначительна, то требуется предварительное центрифугирование. Однако метод электронной микроскопии не позволяет дифференцировать вирусы простого герпеса и ветряной оспы, цитомегалии, поскольку они морфологически практически одинаковы. Использование метода ограничивается его трудоемкостью, малодоступностью, дороговизной, поэтому он применяется в основном в научных целях. Для получения результатов метода электронной микроскопии необходимо около 3-х часов, чувствительность метода составляет 70 %, специфичность около 100 %.

В настоящее время главенствующую роль в верификации герпесвирусных инфекций играют методы ДНК-диагностики, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ДНК-гибридизация.

Гибридизация ДНК – высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его специфического связывания (гибридизации) с меченой комплементарной молекулой ДНК-диагностикума. В качестве маркера применяют ферменты (пероксидазу, щелочную фосфатазу) и изотопы. Недостатком метода является его длительное время выполнения- в среднем 5-7 суток, а также высокая частота ложноотрицательных результатов при низком количестве вирусной ДНК в исследуемой пробе.

Наиболее широко используемым методом диагностики герпетической инфекции является полимеразная цепная реакция (ПЦР), предложенная Мюллисом в 1983 году. В основе метода лежит катализируемая ферментом ДНК-полимеразой многократное образование копий (ампликация) определенного участка ДНК, представляющего диагностический интерес. Для ампликации отбирают уникальный ген, который наиболее четко отличает определяемый патоген от прочих.

Различают качественный, полуколичественный и количественный варианты метода. При проведении качественной ПЦР определяют лишь факт присутствия вируса, однако не возможным является оценка его репродуктивной активности, что не позволяет провести дифференциальную диагностику между латентными, персистирующими и реактивными формами инфекции. Полуколичественная ПЦР дает информацию о содержании копий вирусных ДНК в виде условных обозначений (+, ++, +++, ++++). Методом, позволяющим получить числовые значения, отражающие репродуктивную активность вируса является количественная ПЦР. Полученный количественный результат не соответствует истинному содержанию ДНК возбудителя в исследуемой пробе. При этом существует определенная пропорциональность между исходным количеством ДНК вируса и конечным результатом исследования. Такая пропорциональность соблюдается лишь при проведениидиагностики в стандартных условиях с использованием одних и тех же реактивов, поэтому сравнительный анализ полученных результатов в динамике проводят при обследовании пациента в одной лаборатории.

Ложноотрицательные результаты возможны при несоблюдении технологий и использовании некачественных реактивов. Ложноположительные данные возможны при подсчете результатов методом электрофореза, что обусловлено контаминацией воздушной среды рабочего пространства ампликонами при предварительных постановках, поэтому используют открытые методики подсчета результатов с надлежащей вентиляцией помещений и закрытые, которые являются более предпочтительными, так как предполагают отсутствие прямогоконтактамежду продуктами реакции и воздушной средой.

Наиболее точной является методика ПЦР в реальном времени (real time ПЦР). Ее особенностью является подсчет количества амплифицированных ДНК по мере их накопления после каждого цикла, а не в конце постановки ПЦР.

Даже количественная ПЦР не всегда позволяет отдифференцировать латентную и реактивированную инфекции. В этом случае рекомендуют использовать ПЦР обратной транскрипции, с помощью которой подсчитывают количество вирусной м-РНК, которое свидетельствует об интенсивности экспрессии вирусных генов. ПЦР является точным методом, так как для получения результата достаточно иметь в пробе всего одну молекулу ДНК возбудителя. Чувствительность ПЦР составляет 98%, а специфичность – 94 %. РезультатыПЦР можно получить уже через 3-6 часов после начала проведения.В стоматологической практике ПЦР широко применяется в диагностических целях. Установлена зависимость уровня вирусной активности в ротовой жидкости от степени тяжести герпетической инфекции.

Определения вирусных антигенов возможно при помощи реакции иммунофлюорисценции.

Этот метод основан на использовании иммуноглобулинов, меченных красителями и дающих зеленовато-желтую или красную флюорисценцию. Результаты метода учитывают при люминисцентой микроскопии препаратов обработанных меченными антителами. Метод иммунофлюорисценции используют в двух вариантах: прямой (ПИФ) и непрямой (НИФ). При прямом методе красителями метят антитела, непосредственно взаимодействующие с антигеном. При непрямом методе с исследуемым антигеном взаимодействуют специфические антитела, а уже с ними антивидовые антитела, меченые флюорохромом. Эти методы в какой то мере дублируют результаты ПЦР и могут быть полезны для исключения ложноположительных или ложноотрицательных результатов ДНК-диагностики. Чувствительность метода – 55-75 %, специфичность – 90 %. Метод нашел широкое применение в стоматологической практике для уточнения диагноза.

Серологические методы диагностики герпеса:

(реакции нейтрализации, связывания комплемента, гемагглютинации, иммунофлюорисценции и др.) позволяют оценить характер и напряженность специфического гуморального иммунитета. Все эти методы позволяют с разной степенью достоверности установить факт инфицирования пациента с вирусом. Диагностика основывается на наличии противогерпетическихIg M и Ig G. Наличие специфического Ig M свидетельствует об остроте процесса (первичная инфекция, реинфекция, реактивация). При первичной герпесвирусной инфекции противогерпетический Ig M появляется на 7-14 сутки после инфицирования и циркулирует 1-3 месяца. У отдельных лиц может сохраняться на протяжении длительного времени, давая ложную информацию об остроте процесса. Противогрепетические Ig G являются антителами вторичного иммунного ответа. При первичной инфекции выявляются во второй половине инфекционного процесса, а также при латентной, персистирующей инфекции и реактивации вируса. Рекомендуют применять метод парных сывороток, оценивая титр специфических антител с промежутком в 2-3 недели. Однако четырехкратное повышение титра специфическогоIg G является диагностическим критерием лишь при первичном инфицировании. Проведение серологических исследований позволяет оценить иммунный статус организма. Так, расхождение между показателями ПЦР, свидетельствующими о высокой репродуктивнойактивности вируса, и данными серологических исследований, показывающими низкий титр специфических антител, свидетельствует о недостаточности специфического гуморального иммунного ответа и является показанием к назначению заместительной терапии (препаратов специфических иммуноглобулинов) или средств, повышающих антителогенез (полиоксидоний, спленин и др.).

Иммунологические исследования являются обязательными при манифестных формах инфекции, так как вирус способен оказывать иммуносупрессивное действие на зараженный организм. Результаты таких исследований позволяют выявить иммунный дефект и назначить рациональную терапию. Метод применяется для выбора средств иммунотерапии и оценки их эффективности при лечении герпетических стоматитов.

Таким образом, диагностическими критериями герпетической инфекции полости рта являются:

-выявление вирусных агентов в крови, слюне, соскобах и мазках-отпечатках с элементов поражения достоверными методами: ПЦР, методом иммунофлюорисценции;

— в спорных случаях для экспресс-диагностики необходимо проводить цитологическое исследование с целью выявления клеток Тцанка;

— для диагностики первичной герпетической инфекции важным является выявление вирус-специфических иммуноглобулинов M и G.

При постановке диагноза обязательно учитывают наличие клинических признаков герпетической инфекции (типичных элементов поражения).

Для назначения рациональной противовирусной и иммунотерапии рекомендуется проведение следующих исследований:

— определение противогерпетических антител классаM, G и А для оценки напряженности специфического гуморального иммунитета;

— иммунологическое исследование проводят при тяжелом или атипичном течении и частых рецидивах герпетической инфекции, при низкой чувствительности к лечению ацикловиром и его аналогами.

Источник