Вирус герпеса спинномозговая жидкость

Detection of herpes viruses in the cerebrospinal fluid of adults with suspected viral meningitis in Malawi
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3566386/

Мы искали вирусы простого герпеса типа 1 и 2 (соответственно HSV-1 и HSV-2), вирус вируса ветряной оспы (VZV), вирус Эпштейна-Барра (EBV) и цитомегаловирус (CMV) у взрослых малазийцев с клинически подозрением на менингит.

Мы собрали цереброспинальную жидкость (CSF) у последовательных взрослых, госпитализированных с клинически подозреваемым менингитом в центральную больницу Королевы Елизаветы (QECH), Блантир, Малави, в течение 3 месяцев. Те, у кого был доказанный бактериальный или грибковый менингит, были исключены. В реальном времени полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на CSF для ДНК HSV-1 и HSV-2, VZV, EBV и CMV.

В общей сложности 183 пациента с клинически подозрением на менингит. Из них 59 (32%) имели доказанный менингит (бактериальный, туберкулезный или криптококковый), у 39 (21%) был нормальный СМЖ, а у 14 (8%) был асептический менингит. Для последней группы вирус герпеса был обнаружен у 9 (64%): у 7 (50%) был ВЭБ, а у 2 (14%) был ЦМВ, все они были инфицированы иммунодефицитом человека (ВИЧ). HSV-2 и VZV не были обнаружены. Среди людей с нормальным СМЖ у 8 (21%) был обнаруженный вирус герпеса, из которых 7 (88%) были ВИЧ-инфицированными.

Спектр причин вирусного менингита герпеса в этом африканском населении отличается от спектра в западных индустриальных условиях, при этом EBV часто обнаруживается в CSF. Значимость этого требует дальнейшего изучения.

В африканских условиях считается, что асептический менингит распространен, но этиология редко выявляется, и было мало исследований, изучающих этот вопрос [1, 2]. В промышленно развитых странах, где возможна более тщательная диагностическая диагностика, до 50% случаев было установлено, что вирусная причина [3, 4].

Реактивация вирусов простого герпеса (HSV) 1 и 2, вирус ветряной оспы (VZV), вирус Эпштейна-Барра (EBV) и цитомегаловирус (ЦМВ) распространены в контексте инфекции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и вируса ВИЧ-герпеса коинфекция была связана с более тяжелым течением заболевания [5, 6]. В то время как все пять вирусов могут вызывать менингит у ВИЧ-инфицированных взрослых, инфекция EBV чаще ассоциируется с лимфомой центральной нервной системы (ЦНС), тогда как ЦМВ чаще является причиной энцефалита, радикулита или ретинита [5, 7-9].

В странах Африки к югу от Сахары очень мало известно о распространенности ВПГ, VZV, EBV и ЦМВ в качестве причин асептического менингита в контексте ВИЧ. Поэтому мы искали инфекции HSV, VZV, EBV и CMV у взрослых малазийцев с клинически подозрением на менингит, но без признаков бактериальной или грибковой инфекции.

Это исследование было суб-анализом цереброспинальной жидкости (CSF) из когорты взрослых (в возрасте 16 лет) с клинически подозреваемым менингитом, допущенным в Центральную больницу королевы Елизаветы (QECH), Блантир, Малави, с сентября по декабрь 2007 года [ 10]. Демографические данные и клиническая информация были собраны с использованием стандартизованной формы регистрации случая. Все лица дали свое информированное согласие до включения в исследование. Проводилась рутинная микроскопия и культура CSF и исключались пациенты с микробиологически подтвержденным бактериальным, криптококковым или туберкулезным менингитом, как и те, у которых вероятный бактериальный менингит (полиморфные клеточные полимеры CSF> 100 клеток на мм3). Пациенты с диагнозом инфекции ЦНС в течение последнего месяца также были исключены; это в первую очередь было сделано для обеспечения того, чтобы у нашей когорты пациентов были новые клинические события и чтобы не было выбора тех, у кого был рецидив инфекции ЦНС. Пациенты с ≥5 белыми клетками на мм3 CSF определялись как имеющие асептический менингит, тогда как у пациентов с

Исследование было одобрено местным комитетом по этике в Медицинском колледже, Университете Малави, Блантире, Малави (P05 / 06/471) и медицинском факультете комитета по этике, Университет Гейдельберга, Гейдельберг, Германия (S 026/2007).

Образцы CSF аликвотировали и хранили при -70 ° C до молекулярной диагностики для HSV, VZV, EBV и CMV. Образцы были испытаны как партия во время этого исследования.

ДНК экстрагировали из 200 мкл CSF с использованием набора ДНК QIAamp в соответствии с инструкциями производителя. Восстановление ДНК подтверждается спектроскопическим анализом. Мы использовали 5 мкл ДНК для каждой полимеразной цепной реакции (ПЦР) для анализа HSV, VZV и EBV и 10 мкл для анализа CMV.

Праймеры и зонды, нацеленные на консервативные области гена ДНК-полимеразы, были использованы для HSV-1 (праймер: GAC AGG GAA TTC GAG ATG CTG, обратный ATG ТТГ TAC CCG GTC ACG AAC T; зонд: 5′-FAM-CAT GAC CCT TGT GAA ACA-MGB-3′-BHQ1); HSV-2 (праймер: тот же, что и HSV-1, зонд: 5′-VIC-TGA CCT TCG TCA AGC AG-MGB-3′-BHQ1) и VZV (праймер: forward-GCG CGG TAG TAA CAG AGA ATT TC, обратный -ACG TGC ATG GAC CGG TTA AT, зонд: 5′-FAM-ACC ATG TCA TCG TTT CAA-MGB-3′-BHQ1). Аналогичным образом были нацелены протеины (гена BNFR1) для EBV и UL123 / UL 55 генов генома CMV [12, 13].

Applied Biosystems (ABI, UK) AmpliTaq Gold (2 ×) Master Mix использовали для всех анализов ПЦР в реальном времени. Все реакции проводили в машине ПЦР реального времени ABI 7300 с использованием 96-оптических планшетов с общим объемом 25 мкл на лунку. Условия термоциклирования ПЦР для всех анализов включали три стадии; активацию УНГ при 50 ° С в течение 2 мин, активацию Taq при 95 ° С в течение 15 мин с последующей амплификацией с использованием 45 циклов при 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 1 мин.

Положительный контроль (предоставленный Национальным институтом биологических стандартов и контроля, Великобритания) для каждого вируса герпеса проводился с неизвестными образцами для обеспечения восстановления ДНК. Аналогично, образцы обрабатывались параллельно с аликвотами молекулярной воды для мониторинга ложноположительных результатов; запуск был отброшен, если это было так. Каждый отдельный образец обрабатывали в трех повторностях, и образец считался положительным, если два или более из трех результатов теста были положительными. Когда только один из трех результатов теста был положительным, тест ПЦР повторяли (n = 3), и тогда образец считался положительным, если результат теста был положительным (n = 1). Количественная оценка проводилась только с EBV и показана как копии генома на миллилитр CSF. Серийное разведение 100-108 копий / мл вирусного запаса использовали для получения стандартной кривой с эффективностью 92%. Концентрация генома EBV в образцах была интерполирована по этой стандартной кривой.

Известно, что VZV обладает высоким генотипическим разнообразием [14]. Чтобы гарантировать, что праймеры ПЦР были подходящими для штаммов VZV, циркулирующих в Малави, были также проанализированы тампоны (хранящиеся в вирусной среде), взятые из пузырьков четырех пациентов с классической черепицей (везикулярная сыпь в дерматомическом распределении). Везикулярные образцы всех четырех пациентов с черепицей дали положительные результаты.

Был проведен анализ чувствительности для определения предела обнаружения с использованием панелей QCMD (Qnostics Ltd., Великобритания). Мы обнаружили, что для каждого вируса ограничение обнаружения составляет 103 копий / мл или менее.

Данные были проанализированы с использованием PASW Statistics 18, Release Version 18.0.0 (Ó SPSS, Inc., 2009, Chicago, IL, https://www.spss.com). Количественные переменные были выражены как медианы с межквартильными диапазонами и качественными переменными в виде частот и процентов. Точный критерий Фишера использовался для сравнения категориальных данных и теста Манна-Уитни U для непрерывных данных; значение p

В течение 3-месячного периода исследования было выявлено 183 пациента с клинически подозрением на менингит. Из них 59 (32%) имели доказанный менингит (бактериальный, туберкулезный или криптококковый), у 39 (21%) был нормальный СМЖ, а у 14 (8%) был асептический менингит. У 48 (26%) пациентов наблюдался рецидив предшествующей инфекции ЦНС (рис.1). Тридцать шесть (68%) из 53 пациентов с нормальным или асептическим CSF были ВИЧ-положительными, средний показатель CD4 159 мм3 (межквартильный диапазон 107-270 мм3). 1Flow диаграмма, описывающая выбор подходящих участников и их классификацию. ЦНС центральной нервной системы, ЦНС спинномозговой жидкости, ЛП поясничной пункции

В целом, в группе асептического менингита был обнаружен вирус герпеса в CSF 9/14 (64%); все они были ВИЧ-инфицированными. Среди тех, у кого нормальный CSF, у 8/39 (21%) был обнаруженный вирус герпеса; из них 7 (8%) были ВИЧ-инфицированными.

Распространенность индивидуального герпеса у лиц с асептическим менингитом (14) составила 7 (50%) EBV и 2 (14%) ЦМВ. У пациентов с нормальным CSF (39) 6 (15%) имели EBV и 2 (5%) были обнаружены HSV-1. Ни один из пациентов не обнаружил HSV-2 или VZV (таблица 1). Таблицы 1Демократики, характеристики CSF и обнаружение вирусов герпеса у 53 пациентов с подозрением на вирусный менингит

Интерквартильный интервал IQR, количество белых клеток WCC, цереброспинальная жидкость CSF

Сравнивая скорость обнаружения у ВИЧ-инфицированных и ВИЧ-отрицательных пациентов, мы обнаружили, что только один ВИЧ-отрицательный пациент обнаружил вирус герпеса в CSF (HSV-1) по сравнению с 16 ВИЧ-положительными пациентами. Тринадцать (36%) пациентов с ВИЧ-инфекцией выявили EBV в CSF.

Чтобы исследовать значимость высокой распространенности EBV, обнаруженной исключительно в ВИЧ-положительной группе, мы исследовали взаимосвязь между титром EBV CSF, количеством белых клеток CSF (WCC) и количеством CD4. Средний титр EBV у пациентов с нормальным CSF (

Мы обнаружили, что асептический менингит составлял 8% пациентов с клинически подозрением на менингит в нашей обстановке. Удивительно, что в асептической CSF не было обнаружено ни одной ДНК ВПГ-2 или VZV; вместо этого мы обнаружили высокую распространенность ВЭБ, и все эти пациенты были ВИЧ-инфицированы.

Распространенность асептического менингита в нашей когорте была ниже, чем в западных промышленно развитых странах, где асептический менингит составляет около 50% острого менингита [15]. Насколько нам известно, есть только две другие публикации, в которых изучался асептический менингит в странах Африки к югу от Сахары; один в Зимбабве обнаружил, что частота мононуклеарного менингита составляет 27%, в то время как другая в Южной Африке обнаружила, что частота составляет 59%; ни в поисках вирусной этиологии [1, 2].

Можно предположить, что низкая частота может быть вызвана уклонением от установления, поскольку у пациентов с асептическим менингитом более мягкая самоограничивающая болезнь и, следовательно, нет в больнице. Альтернативно, продвинутая ВИЧ-инфекция может модулировать воспалительную реакцию на вирусные инфекции в ЦНС, и поэтому плеоцитоз отсутствует. Это может иметь отношение к 6 из 39 пациентов с нормальным CSF и детектируемым EBV.

Наш отказ обнаружить HSV-2 и VZV в этой когорте был неожиданным, поскольку оба являются общими идентифицируемыми причинами вирусного менингита в западных промышленно развитых странах [16, 17]. Возможно, что спектр причин вирусного менингита герпеса у населения с высокой распространенностью ВИЧ отличается от спектра в западных промышленно развитых странах.

Поразительным было обнаружение высокого уровня EBV в CSF ВИЧ-инфицированных людей, даже у тех, у кого нормальный CSF. Наличие EBV в CSF людей с ВИЧ обычно связано с первичной лимфомой ЦНС, а не с менингитом [5, 18]. Невозможно исключить возможность того, что некоторые из наших пациентов могли иметь лимфому, поскольку мозговая визуализация или биопсия обычно не были доступны во время исследования, но клинические проявления острого менингита сильно отличались от хронического измененного психического статуса или фокуса неврологический дефицит, который обычно наблюдается у пациентов с лимфомой ЦНС [19].

Высокое обнаружение EBV в CSF может иметь отношение к клиническому проявлению или может отражать активацию у пациентов с ослабленным иммунитетом, которые не имеют патогенного значения. Тем не менее, обнаружение EBV было значительно выше у пациентов с повышенным CSF WCC. В идеале нам хотелось бы изучить связь EBV с клиническим исходом, но ретроспективный характер нашего исследования ограничил это. Недавно мы описали связь с высокими титрами EBV в CSF и плохим исходом у пациентов с бактериальным менингитом, что говорит о том, что в этой истории может быть больше [20].

В заключение мы увидели различный спектр вирусных инфекций герпеса в этой популяции, чем в западных индустриальных условиях. EBV часто обнаруживался в CSF, независимо от того, был ли плеоцитоз или нет, хотя более высокие вирусные титры наблюдались у пациентов с плеоцитозом и у ВИЧ-положительных пациентов. Значение этих результатов заслуживает дальнейшего изучения.

Авторы хотели бы подтвердить помощь Жаки Монтгомери. Мы благодарим Пола Клаппера за полезные обсуждения, Пол Уоллес из Qnostics Ltd., Глазго, Великобритания и Хизер Карр из Национального института биологических стандартов и контроля (NIBSC), Potters Bar, Великобритания, за их щедрое пожертвование панелей чувствительности и контроля для анализа ПЦР и группы исследования M & M для предоставления необработанных данных. Эта работа была поддержана Советом медицинских исследований и Wellcome Trust. Клиническое исследование было частично поддержано грантом Gilead HIV Clinical Cooperation Grant.

Авторы заявляют, что конкурирующих интересов нет.

Эта статья распространяется в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution, которая разрешает любое использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал (ы) и источник зачисляются.

Вирус простого герпеса 1

Вирус простого герпеса 2

Вирус Varicella zoster

Вирус Эпштейна-Барра

вирус цитомегалии

Вирус иммунодефицита человека

Количество белых клеток

Количество красных клеток

Спинномозговая жидкость

Центральная нервная система

Полимеразной цепной реакции