Crispr cas9 герпес 2017

Bethesda, MD / U.S. National Library of Medicine / NIH / HHS

Роман Фишман

Уточнение: В исходной версии статьи ошибочно утверждалось, что герпесвирусы в латентной фазе не просто пассивно находятся в клетках, но и интегрируются в клеточный геном. В действительности такое поведение характерно для ретровирусов, в т.ч. ВИЧ, но не для герпесвирусов. Редакция приносит извинения своим читателям.  

Julio C. Valencia / NCI Center for Cancer Research

В США появились первые промежуточные итоги клинических испытаний CRISPR-варианта CAR-T терапии для борьбы с раком. Об этом сообщила пресс-служба медицинского центра Пенн при Пенсильванского университете. Три пациента получили инъекции отредактированных клеток, те прижились в их кровотоке и не вызвали ухудшения. Однако ответ пациентов на терапию врачам пока зафиксировать не удалось.

Несмотря на то, что технологии CRISPR-редактирования посвящают все больше научных исследований, ни одно ее применение в медицине до сих пор не одобрено официально. Известно только несколько клинических испытаний, в ходе которых CRISPR-отредактированные клетки вводили в организм пациентов: одни проходили в Китае, другие — в Европе.

Теперь пилотные испытания добрались и до США. В медицинском центре Пенн врачи опробовали CRISPR-терапию, нацеленную на борьбу с раком. Фактически это модификация генной терапии CAR-T, которую одобрили для применения в 2017 году.

Исходная методика CAR-T построена на модификации генома Т-лимфоцитов. Их программируют на борьбу с В-лимфоцитами, которые размножаются при некоторых видах рака крови. Для этого в Т-клетки с помощью вирусных векторов вводят ген, который кодирует рецептор к поверхностному белку В-клеток. Модифицированные клетки размножают и вводят обратно в организм, где они прицельно атакуют опухоль.

CRISPR-вариант CAR-T похож на оригинал лишь общим принципом. У пациентов так же забирают Т-клетки и редактируют их геном. Однако в новом методе ученые используют CRISPR/Cas9, чтобы удалить из ДНК Т-клеток два гена: один — белок PD-1, который блокирует активность лимфоцитов (за его открытие в 2018 году присудили Нобелевскую премию). Второй — обычный рецептор, с помощью которого лимфоциты узнают свою мишень. Затем посредством вирусного вектора в клетки вводят ген другого рецептора, который связывается только с определенными белками на поверхности опухоли. После такого тройного редактирования Т-лимфоцит получает способность избирательно распознать раковую клетку, а заодно приобретает устойчивость к ее подавляющему действию.

По словам ученых, в пробном испытании приняли участие три пациента: двое со множественной миеломой и один — с саркомой. Все трое получили разовую инъекцию отредактированных клеток после короткого курса химиотерапии. Позже анализы крови показали, что CAR-T-клетки прижились и размножились в их организме. Об эффективности процедуры судить пока рано, поскольку врачи еще не заметили ответа пациентов на терапию. Однако они уже с уверенностью говорят об отсутствии побочных симптомов, что немаловажно — один вид CAR-T терапии уже потерпел поражение из-за внезапной смерти пациента.

В разговоре с пресс-службой медицинского центра исследователи упомянули, что редактирование привело к образованию «разных вариантов» клеток, и среди них предстоит выбрать наиболее активные. Это может означать одно из двух: либо не во всех клетках удается внести все три изменения в ДНК, либо в некоторых возникают нецелевые исправления. И то, и другое может стать препятствием для дальнейшего развития этого метода. Точнее это будет известно через месяц, когда ученые представят результаты своих испытаний.

Подробнее о том, как работает технология CAR-T, читайте в нашем материале «Химера против рака». А о том, какие трудности возникают при применении CRISPR/Cas для редактирования генома, в том числе зародышей, рассказывает наш текст «В режиме редактирования».

Полина Лосева

NIAID / Flickr

Китайские врачи опробовали CRISPR-отредактированные клетки на пациенте с ВИЧ-инфекцией и Т-клеточной лейкемией. После облучения больному ввели его собственные кроветворные клетки, в которых разрушили ген CCR5. Отредактированные клетки прижились в организме и образовали разные типы клеток крови. Серьезных побочных эффектов не возникло. Правда, защитить пациента от вируса они не смогли — из-за низкой эффективности редактирования. Статья опубликована в журнале New England Journal of Medicine.

Мутация CCR5Δ32 делает Т-клетки человека устойчивыми к заражению ВИЧ. Пересадка клеток крови от донора с мутацией может спасти больного от инфекции — как это было в случае с «берлинским пациентом», а потом с «лондонским» и, возможно, «дюссельдорфским». Однако в Европе носителей этой мутации всего несколько процентов от населения и подобрать полностью совместимого донора довольно сложно. А в некоторых странах (например, в Китае), где носителей практически нет, это и вовсе превращается в невыполнимую задачу. 

Современные технологии редактирования генома позволяют обойтись и без донора. Для этого нужно взять собственные клетки пациента и ввести в них необходимую мутацию или просто разрушить соответствущий ген. Впервые на это решилась компания Sangamo Therapeutics: в 2014 году они отчитались о первом клиническом испытании. Для редактирования генома исследователи использовали нуклеазу «цинковые пальцы». Это фермент, в составе которого есть участки — собственно, «пальцы» — способные распознать определенную последовательность в ДНК, и участок, способный внести разрыв в нить ДНК рядом с этой последовательностью. У 12 пациентов забрали Т-клетки крови, внесли в их геном изменение и вернули в организм. В этот момент испытуемых перестали лечить от ВИЧ. Отредактированные клетки прижились в теле пациентов, однако сделать их полностью устойчивыми не смогли — всем, кроме одного, пришлось вернуться к антиретровирусной терапии. После этого Sangamo Therapeutics прекратила свои разработки лекарства от ВИЧ и переключилась на борьбу с другими болезнями.

С тех пор на смену «цинковым пальцам» пришла новая технология редактирования генома — система CRISPR/Cas9. Она выгодно отличается тем, что за распознавание ДНК в ней отвечают не белки, а молекула РНК, которую быстрее синтезировать и проще сделать специфичной к той или иной последовательности. 

CRISPR-модифицированные клетки прижились в организме и не вызвали острого отторжения. С начала эксперимента прошло уже 19 месяцев, и клетки с разрушенным геном CCR5 все еще можно найти в крови пациента — причем не только Т-лимфоциты, но и другие клетки крови. Это значит, что отредактированные кроветворные клетки работают полноценно и производят разные типы клеток, у которых мутация сохраняется.

Тем не менее, полностью отредактировать кроветворение пациента не удалось. Среди всех клеток, которые ученые у него забрали для редактирования, внести изменения в геном получилось лишь у 17,8 процентов. После возвращения в организм новые клетки начали конкурировать со старыми за заселение красного костного мозга. И в течение всего времени наблюдения они составляли лишь 5-8 процентов от общей кроветворной популяции.

Однако сделать пациента устойчивым к вирусу не удалось: после отмены ретровирусной терапии количество вирусной РНК в крови начало расти, и ему пришлось снова назначить лечение, чтобы инфекция не прогрессировала. В этом смысле китайский эксперимент, равно как и испытание Sangamo Therapeutics, не достиг заявленной цели. Причиной тому стала низкая эффективность редактирования. В китайском эксперименте она была ниже 20 процентов, в исследовании Sangamo Therapeutics — 11-28 процентов, и этого количества клеток недостаточно, чтобы справиться с инфекцией. Для того, чтобы ввести технологию редактирования генов в клиническую практику борьбы с ВИЧ, исследователям придется сначала повысить эффективность метода.

Тем не менее, авторы работы отмечают, что у их исследования есть и позитивный результат. Этот эксперимент — самое долгое на сегодняшний день наблюдение за CRISPR-отредактированными клетками в организме человека, и оно показывает, что такие клетки могут быть безопасны. Исследователи не обнаружили в клетках никаких незапланированных изменений (то есть следов нецелевого редактирования генома). Клетки также не превратились в опухолевые — о чем предупреждали некоторые ученые в 2018 году. Таким образом, китайская работа стала демонстрацией принципа: CRISPR-модифицированные клетки можно использовать в терапевтических целях без риска для пациента.

Китайские ученые — правда, другие — уже пробовали решить проблему устойчивости к ВИЧ с помощью генетического редактирования. Так на свет появились генетически модифицированные дети, которые должны были, по замыслу экспериментаторов, нести в геноме мутацию CCR5Δ32. Об этом читайте в нашем материале «Исправленная редакция». Однако с тех пор появилось множество данных о том, какие дополнительные роли эта мутация может играть в организме. Так, выяснилось, что CCR5Δ32 может повышать смертность своих носителей. В таком случае генетическое редактирование отдельных клеток может стать хорошим решением проблемы — оно не вызывает этических споров и не подвергает пациента дополнительным рискам.

Полина Лосева