Герпеса в культуре клеток
Посев на культуре клеток (ВПГ, ЦМВ) — не только выявляет вирус, но и даёт информацию о его активности (агрессивности). Анализ результатов посева на фоне лечения, позволяет делать заключение об эффективности проводимой терапии.
Вирус простого герпеса (ВПГ), или герпес, бывает двух видов: вирус простого герпеса первого типа (ВПГ-1) и вирус простого герпеса второго типа (ВПГ-2). Обе формы вируса — высококонтагиозны.
Основной путь передачи герпеса: воздушно-капельный, контактный, половой, внутриутробный, гемотрансфузионный, при пересадке органов. Первичная герпевирусная инфекция и реактивация инфекции (в гораздо меньшей степени) в период беременности могут вызывать патологию беременности или внутриутробное инфицирование плода. Причиной внутриутробного инфицирования плода чаще бывает ВПГ-2, но не исключено заражение и ВПГ-1. Кроме того, роженицы могут передать вирус новорождённому при родах, что может вызвать неонатальный герпес — редкое заболевание с летальным исходом.
ВПГ-1 (Herpes Simplex virus I) — передаётся через оральный контакт и зачастую вызывает «простуду» на губах (оролабиальный герпес).
К типичным симптомам ВПГ-1 относят:
- высыпание на губах и слизистой оболочке рта группы скученных мелких пузырьков (везикул), наполненных прозрачным содержимым;
- воспалённость, отёчность кожи и слизистой в области высыпаний.
ВПГ-1 также может вызвать генитальную форму заболевания. Заболевание губ, вызванное вирусом I типа, постепенно может перейти и на другие слизистые, в том числе, и на половые органы. Заражение может произойти в результате непосредственного контакта с инфицированными половыми органами при половом сношении, при трении половых органов друг о друга, при орально-генитальном контакте, анальном половом акте или орально-анальном контакте. И даже от больного полового партнёра, у которого внешние признаки болезни пока отсутствуют.
ВПГ-2 — относится к числу инфекций, передаваемых половым путем, которые могут вызвать генитальный герпес.
Распространяется, главным образом, половым путём при кожном контакте.
Вирус генитального герпеса Herpes simplex 2 типа поражает, преимущественно, покровные ткани (эпителий) шейки матки у женщин и полового члена у мужчин, вызывая боль, зуд, появление прозрачных пузырьков (везикул) на месте которых образуются эрозии/язвочки. Однако при оральных контактах возможно поражение покровной ткани губ и ротовой полости.
HSV и беременность
У беременных: вирус может проникнуть через плаценту в плод и вызвать у него врождённые дефекты. Герпес может вызвать также самопроизвольный аборт или преждевременные роды. Но особенно вероятна опасность заражения плода в процессе родов, при прохождении через шейку матки и влагалище при первичной или рецидивирующей генитальной инфекции у матери. Такое заражение на 50% повышает смертность новорождённых или развитие у них тяжёлых повреждений головного мозга или глаз. При этом определённый риск инфицирования плода существует даже в тех случаях, когда у матери ко времени родов отсутствуют какие-либо симптомы генитального герпеса. Ребёнок может заразиться и после рождения, если у матери или у отца имеются поражения, во рту, или получить вирус с материнским молоком.
Цитомегаловирус (или ЦМВ) — это разновидность из группы герпесвирусов (Herpesvirus), относящаяся к роду Cytomegalovirus подсемейства 3-herpesviridae. Встречается везде. Статистика частоты встречаемости очень вариативна — вероятно, из-за того, что у значительной массы носителей вируса заболевание протекает бессимптомно. Способов полного излечения от герпеса пока нет, т.е. заражённый человек остается носителем возбудителя на всю жизнь.
ЦМВ — это инфекция, сходная с герпесом или ветрянкой, только с гораздо более серьёзными и неожиданными последствиями — от повреждения внутренних органов до необратимых изменений ЦНС. Определить данное заболевание на ранних стадиях проблематично, его точный инкубационный период пока неизвестен. Проявления инфекции могут быть приняты за воспаление органов мочеполовой системы, обычные недомогания типа ОРВИ (острая респираторная вирусная инфекция) и прочие обычные болезни. Весьма часто ЦМВ приводит к возникновению многочисленных воспалений сразу в нескольких внутренних органах.
При беременности вирус не всегда передаётся от больной матери к ребёнку. Но если инфицирование ЦМВ произошло в период беременности или болезнь усилилась, то вероятность передачи заболевания плоду значительно возрастает.
Цитомегаловирусная инфекция передаётся половым путем, через слюну, материнское молоко, при беременности (от матери к ребёнку), через общую мочалку, полотенце, посуду и т.д.
Наиболее часто цитомегаловирусная инфекция проявляется как острая респираторно-вирусная инфекция. От больных поступают жалобы на общее недомогание, насморк, быструю утомляемость. Происходит увеличение и воспаление слюнных желёз, сопровождающееся беловатым налётом на языке и дёснах, а так же обильным выделением слюны.
При генерализованной форме ЦМВ-инфекции, наблюдается поражение паренхиматозных (внутренних) органов. Воспаляются почки, поджелудочная железа, печёночная ткань, селезёнка, надпочечники. Это сопровождается «беспричинными», на первый взгляд, бронхитами и пневмониями, которые плохо поддаются лечению антибиотиками. У больных снижается иммунный статус, в периферической крови становится меньше тромбоцитов. Довольно часто наблюдаются поражения стенок кишечника, периферических нервов, сосудов глаз и головного мозга. Увеличиваются подчелюстные и околоушные слюнные железы, воспаляются суставы. Могут появиться высыпания на коже.
У женщин и мужчин поражение мочеполовой системы даёт симптомы хронического не специфического воспаления. В этом случае, если не обнаружена вирусная природа патологии, лечение заболевания при помощи антибиотиков будет малоэффективно.
Самые серьёзные и опасные осложнения цитомегаловируса — это патология беременности, плода и новорождённого. Если произошло инфицирование плода во время беременности, то риск развития этой патологии будет максимальным. Однако, не стоит забывать, что проблемы могут возникнуть так же у беременных при активации латентной ЦМВ-ифекции, когда вирус попадает в кровь, впоследствии заражая плод. Согласно статистике, ЦМВ является наиболее частой причиной не вынашивания беременности. Внутриутробная цитомегаловирусная инфекция является причиной поражений центральной нервной системы (тугоухость и отставание в умственном развитии). В 20–30% случаев заканчивается смертью ребёнка.
Симптомы герпеса у разных людей могут значительно отличаться. Если у Вас наблюдаются признаки инфекции, рекомендуем Вам пройти исследование «Посев на культуре клеток (ВПГ, ЦМВ)» для выявления герпесвируса на протяжении 48 часов с момента их возникновения.
Преимущества посева на культуре клеток
Главным преимуществом посева на культуре клеток является высокая точность исследования в случае положительного результата. Кроме того, по культуре клеток можно определять, вирусом герпеса какого типа — первого, второго или ЦМВ, была вызвана инфекция. Если результат лабораторной диагностики на культуре клеток окажется у вас положительным, можете быть уверенным, что у вас вирус герпеса.
Основным недостатком посева на культуре клеток является высокий процент ложноотрицательных результатов. Поскольку для посева вирус должен находиться в активном состоянии, если герпетический пузырёк или язвочка маленького размера или уже начинает заживать, то для нормального исследования количества вируса может быть недостаточно. При проведении диагностики позднее, чем через 48 часов после появления симптомов, высока угроза ложноотрицательного результата. Посев вируса на культуре клеток бывает еще менее достоверным при диагностике во время рецидивов (положительные результаты получают лишь в 30% случаев повторных вспышек герпеса).
Подготовка
Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приёма пищи. Кровь берется в пробирку с ЭДТА.
Сбор мочи
Накануне сдачи анализа не рекомендуется употреблять в пищу овощи и фрукты, которые могут изменить цвет мочи (свёкла, морковь, клюква и т.п.), принимать диуретики.
Перед сбором мочи необходимо провести тщательный гигиенический туалет внешних половых органов. Собирают строго утреннюю порцию мочи, выделенную сразу же после сна. Женщинам не рекомендуется сдавать анализ мочи во время менструации; во избежание попадания в мочу выделений из влагалища, рекомендуется ввести во влагалище тампон.
За сутки до сдачи исключить приём алкоголя и половой акт.
Материал собирается в стерильный пластиковый контейнер. Собирается средняя порция утренней мочи. При первом утреннем мочеиспускании небольшое количество мочи (первые 3–5 сек) выпустить в унитаз, а затем, не прерывая мочеиспускания, собрать среднюю порцию мочи в чистую ёмкость. Продолжить мочеиспускание в унитаз. Ёмкость закрыть, промаркировать.
Нужно постараться максимально сократить срок доставки материала в лабораторию. Длительное хранение приводит к размножению бактерий.
Доставить контейнер с мочой в медицинский офис необходимо как можно скорее с момента взятия биоматериала. Моча в стерильном пластиковом контейнере для посева стабильна не более 2 часов при температуре 18–20°С, не более 6 часов при температуре хранения 4–8°С.
Подготовка ко взятию слюны:
- желательно собирать утром;
- зубы не чистить, не есть как минимум 4 часа;
- слюна собирается в стерильный контейнер.
Мазок из урогенитального тракта женщины
Сдача мазка не допускается в дни менструации. За трое суток до взятия необходимо отказаться от применения вагинальных свечей, тампонов, спермицидов, за сутки исключить половые контакты. Нельзя спринцеваться накануне проведения обследования. После УЗИ-исследования с применением вагинального датчика, кольпоскопии, биопсии должно пройти не менее 48 часов.
Мазок из урогенитального тракта мужчины
За 1–2 суток до взятия мазка, необходимо исключить половые контакты. Нельзя мочиться в течение 1,5–2 часов до процедуры.
Интерпретация результатов
Тест качественный. Результат выдаётся в терминах «обнаружено» или «не обнаружено».
Источник
Вирус герпеса размножается во многих различных тканевых культуральных системах, в монослоях эпителиальных клеток почек кролика, обезьяны, амниона человека, куриного эмбриона. Он также размножается в клетках Hela и фибробластах куриного эмбриона и человека. Могут быть использованы и культуры роговицы кролика. Бляшки развиваются в монослоях куриного эмбриона, амниона человека и клеток Hela.
Цитопатогенное действие может проявляться на 2-3 день, но в зависимости от дозы вирус может обнаруживаться и после заражения через 8 ч, когда отдельные клетки начинают округляться и появляются гигантские клетки, содержащие 100 ядрышек. В этот период можно видеть внутриядерные включения. Мы отмечаем три основных проявления ЦПД: пролиферацию и увеличение клеток, округление клеток без пролиферации и формирование гигантских клеток. Нами описан штамм вируса герпеса, который образовывал гигантские клетки.
В первичной культуре почки кролика ЦПД наступает после 12 ч заражения в 30-50% клеток монослоя и полностью через 2 дня.
В первичной эмбриональной культуре клеток куриного эмбриона вирус герпеса генитального происхождения образует бляшки. Визуально бляшки наблюдаются после 2-го дня и имеют размер от 2 до 3 мм. Для того чтобы они были лучше видны и подсчитаны, их можно покрасить нейтральным красным.
Считают, что самое раннее проявление вируса герпеса на клетку заключается в задержке митозов, которая наступает после заражения; через 6 ч наблюдается увеличение ДНК в ядрах. Фаза эклипса, в течение которой отсутствует инфекционность, длится около 12 часов, и вирус выделяется в среду через 15 часов.
Нами был использован МФА в клетках Hela, зараженных вирусом простого герпеса. Мы обнаружили флюоресцирующие образования различной локализации (большие и малые гранулы в ядре, грануляция и диффузная флюоресценция в цитоплазме или около ядерной мембраны). Специфический вирусный антиген обнаруживался МФА, если титр инфекционного вируса в клетках достигал 102’5 1О3’°ТСД5О/О, мл. Было изучено образование инфекционного вируса и вирусного антигена на протяжении 6-15 пассажей в клетках Hela, хронически инфицированных вирусом герпеса. Хроническая инфекция поддерживалась культивированием инфицированных клеток в среде, содержащей 40% человеческой сыворотки со специфическими антигенами. Методом флюоресцирующих антител доказано наличие внутриклеточного вируса и вирусного антигена в инфицированных клетках. Внеклеточный вирус в культуральной жидкости не обнаруживался.
В противоположность активной вирусной инфекции вирусный антиген обнаруживался в хронически инфицированных клетках даже при очень низких титрах внутриклеточного вируса.
P. Sandra и соавторы была показана различная адсорбционная способность клонированных штаммов вируса герпеса, размножающихся (ch+) и не размножающихся (ch ) в клетках куриного эмбриона (КЭ). При одинаковой множественности заражения (100 БОЕ) через 15 мин адсорбировалось 36% ch+ вируса и 50% ch , через 2ч — соответственно 67 и 90%.
Образование вирусных антигенов обоих вирусов было одинаковым в клетках почки кролика, однако в клетках КЭ ch+ вирус образовывал антигены в 8 раз больше. Различий в локализации антигенов, по данным иммунофлюоресценции, не обнаружено.
Многими авторами была изучена чувствительность клеток WI-38, первичных эмбриональных фибробластов, почки эмбриона человека, а также Нер-2 к вирусу герпеса. После однократного заражения культуры поддерживали в течение длительного срока. Через 3 недели только в клетках WI-38 наблюдался ЦПД. Чувствительность этих клеток к вирусу увеличивалась после их обработки диэтиламино-этилдекстраном. В инфицированных клетках обнаруживался комплементсвязывающий антиген.
Кроме того, заражали вирусом простого герпеса ретиналь-ные культуры новорожденных кроликов. Как показали исследования, этот вирус вызывает характерные ядерные изменения в ретинальных культурах и деструкцию нейронов, что может быть использовано при селекции клеточной чувствительности и характеристики биологической особенности вируса герпеса.
Некоторые штаммы вируса герпеса вызывают острую лити-ческую инфекцию культур ткани, а другие размножаются на тех же культурах ткани, формируя синцитий. С понижением окружающей температуры с 37°С до 33°С удается трансформировать острую герпетическую инфекцию в хронический процесс.
Культивирование вируса герпеса можно проводить также на куриных эмбрионах, заражая их в амниотическую полость, желточный мешок, на хорионаллантоисную оболочку или непосредственно в сам эмбрион.
При заражении на хорионаллантоисную оболочку можно наблюдать микроскопические изменения, представляющие собой очаги пролиферации с центральными некротическими участками.
Для куриных эмбрионов первые пассажи вируса герпеса чаще всего не вызывают специфической гибели, а последующие являются летальными для куриного зародыша через 3-5 дней после заражения.
Специфические внутриядерные вирусные включения можно обнаружить во всех органах инфицированных куриных эмбрионов, что считается патогномоничным для этой инфекции.
J. Parker и соавторы, А.Ф. Пухнер наблюдали, что штаммы вируса герпеса генитального происхождения, изолированные от больных с герпетическими поражениями гениталий, продуцировали на хорионаллантоисной оболочке развивающихся куриных эмбрионов большие атипичные некротические поражения. Штаммы вируса герпеса, изолированные ими от пациентов с герпетическими поражениями экстрагенитальной локализации, продуцировали через 24 ч на хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов классические мелкие (1-2 мм) некротические участки поражения. Это может быть использовано для дифференциации штаммов вируса герпеса генитального и экстрагенитального происхождения, так как по морфологическим изменениям в культуре ткани и по ЦПД это сделать не удается .
После первичных цитологических находок в соскобах клеток, взятых у лиц с герпесом, вирус может быть изолирован в 43% случаев, при повторных цитологических находках — в 18% случаев, т.е. как в первые 10 дней после начальных цитологических изменений, так и после 20 дней заболевания герпесом.
W. Ashe и соавторы сообщили об изоляции вируса герпеса симплекс из слюнной железы людей.
У куриных эмбрионов, зараженных на хорионаллантоисную оболочку вирусом герпеса, вирусемия наблюдается в первые сутки после заражения и держится на высоком уровне вплоть до гибели куриного зародыша. Было показано, что при острой герпетической инфекции у куриных эмбрионов во время вирусе-мии вирус связан с эритроцитами с разной интенсивностью.
По данным P.M. Бикбулатова (1986), наибольшей цитомор-фологической чувствительностью к заражению ВПГ обладали из первичных культур ФЭЧ, ПЭЧ, из перевиваемых Vero, СОЦ.
Это может иметь определенное значение и для цитодиагностики ВПГ с использованием клеточных культур.
Им установлено, что ВПГ-инфекция клеточных культур сопровождается выраженными изменениями метаболизма клеток: активизацией окислительно-восстановительных митохондриаль-ных ферментов, увеличением энзимов белкового и углеводного обменов, выходом из клеток лизосомальных гидролитических ферментов и индукцией патологических митозов. Это позволяет думать, что с самых ранних этапов ВПГ-инфекции митохон-дриальный аппарат клетки активно реагирует на воздействие вируса и обеспечивает его энергией для проникновения и последующего биосинтеза.
В.Я. Кицаком (1984) приведено исследование этиологической и патогенетической роли ВПГ-2 в канцерогенезе. Показана трансформирующая активность вируса в культуре клеток, си-нергическое влияние персистентной герпетической инфекции на химический канцерогенез у мышей, усиление коканцероген-ного эффекта ВПГ-инфекции на химический бластогенез в условиях интоксикации организма животных, а также этиопатоге-нетическая связь герпеса гениталий с раком шейки матки человека. Им также установлена способность ВПГ-2 индуцировать трансформацию клеток хомячка, которая фенотипически проявляется в изменении совокупности функциональных морфологических свойств. Этот автор показал, что неопластическая трансформация клеток под влиянием ВПГ-2 является многоэтапным процессом и что молекулярно-генетический механизм индукции трансформации клеток связан с прямым онкогенным действием ВПГ-2.
Изоляция вируса герпеса производится на кроликах, мышах-сосунках, в культурах тканей и в куриных эмбрионах. Кроликов заражают интрацеребрально или в роговицу глаза. Мышей-сосунков заражают интрацеребральным путем, а куриные эмбрионы — в хорионаллантоисную оболочку. Наряду с этим производят инокуляцию вируса герпеса в культуры ткани, чувствительные к этой инфекции, включая ткань роговицы и клетки почки кролика, амнион человека или клетки Hela. Вирус герпеса вызывает в них цитопатические изменения — появление гигантских клеток с внутриядерными включениями. В противоположность этому вирусы герпеса Zoster и ветрянки не способны вызывать инфекционный процесс у белых мышей-сосунков, кроликов, на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона и в клетках роговицы кролика.
Частота выделения вируса герпеса из гениталий больных зависит в определенной степени от использования различных методов изоляции вируса и колебалась, по нашим данным, от 70 до 95,4% случаев.
Для идентификации вируса герпеса применяется ряд серологических реакций. Наиболее широко используются реакции нейтрализации и реакция связывания комплемента (РСК). Кровь берут от пациентов в первые дни заболевания, дают свернуться и отделяют сыворотку. Повторно кровь для получения сыворотки берут через 2-3 нед, т.е. в период выздоровления. Если нельзя сразу исследовать сыворотку, то ее хранят в холодильнике при температуре -20°С.
Koзлoвa В.И., Пyxнep А.Ф.
Герпетическая инфекция, подробнее…
Дополнительная информация:
- Лабораторная диагностика герпеса
- Реакция нейтрализации вируса герпеса на белых мышах
- Вся информация по этому вопросу
Источник
