Материал для диагностики герпеса
Вирусом герпеса заражено практически все население нашей планеты. Существует несколько видов герпеса, и если одни не особенно опасны, то другие могут создать серьезные проблемы со здоровьем, а в определенных ситуациях, например при беременности, последствия деятельности вируса могут стать фатальными.
Масштабы проблемы и роль диагностики герпеса
Герпес можно назвать самым распространенным вирусным заболеванием в мире. Заразиться им очень просто — он может передаваться при любых контактах (поцелуях, половом акте), во время родов от матери к ребенку, бытовым путем, иногда — воздушно-капельным. К моменту достижения взрослого возраста герпесом заражен практически каждый.
Попадая в кровь, вирус может жить в организме годами, никак не проявляя себя. Но рано или поздно он дожидается момента, когда наша иммунная система слабеет. Спусковым крючком может стать серьезная болезнь, стресс, переутомление и хроническая нехватка сна, переохлаждение, гормональная перестройка, словом, практически любая встряска для организма.
Проявления герпеса зависят от типа вируса.
Существует 8 типов герпеса:
- Герпес 1-го типа. Самый распространенный тип. Именно он вызывает появление зудящих пузырьков, наполненных жидкостью, на губах, языке, слизистых оболочках рта. Иногда за несколько часов перед появлением пузырьков человек чувствует повышение температуры и слабость, хотя очень часто вирус атакует без предупреждения.
На заметку
Около 20% россиян отмечают возникновение пузырьков и язвочек на губах примерно 5–10 раз в году. В этом нет ничего удивительного, так как антитела к герпесу 1-го типа, свидетельствующие о присутствии вируса в организме, обнаруживаются у 99% обследованных.
- Герпес 2-го типа. Приводит к появлению такой же пузырьковой сыпи, но на слизистых оболочках половых органов. Передается при сексуальных контактах. Этот вирус очень опасен для беременных и может приводить к патологиям плода.
- Герпес 3-го типа. Его также называют вирусом ветряной оспы. Он вызывает ветрянку, которая характерна для детей, а также опоясывающий лишай. Сыпь возникает не на слизистых оболочках, а на коже и держится очень долго, около месяца. Сопровождается головными болями, общей слабостью, повышенной температурой.
- Герпес 4-го типа, более известный как вирус Эпштейна-Барра. Характерные для герпеса пузырьки при этом заболевании располагаются на миндалинах, вирус провоцирует очень тяжелую ангину с высокой температурой, слабостью, сонливостью и выраженными болями в горле.
- Герпес 5-го типа (цитомегаловирус). Этим типом герпеса инфицированы многие, но очень часто вирус «спит» и не вызывает никаких характерных симптомов. Однако в активном состоянии цитомегаловирус очень опасен, он вызывает тяжелые поражения внутренних органов. Если беременная женщина заражена герпесом 5-го типа, то велик риск выкидыша или преждевременных родов, а также патологий плода.
- Герпес 6-го типа. Может приводить к развитию экземы, а также лимфосаркомы и лимфомы.
- Герпес 7-го типа. Таинственный вирус, единственным явным проявлением которого является хроническая усталость, с которой не в силах справиться ни сон, ни отдых. Со временем развиваются проблемы с памятью и концентрацией внимания, человек становится раздражительным и апатичным, страдает иммунитет. Как правило, при таких симптомах люди не считают нужным обращаться к врачам и даже не подозревают, что синдром хронической усталости может быть вызван вирусной инфекцией.
- Герпес 8-го типа. Довольно редкое и малоизученное заболевание, поражающее лимфоциты, чаще всего обнаруживается у ВИЧ-инфицированных и проявляется возникновением на коже мелких язвочек. Активизируется при развитии саркомы Капоши.
Важно
Герпес часто называют «простудой», но это неверно — вирус герпеса не имеет никакого отношения к возбудителям ОРЗ, и никакие средства от простуды, будь то антибиотики, жаропонижающие или какие-либо другие лекарства, при герпесе не помогут.
Многие считают, что избавиться от герпеса невозможно. И в этом утверждении есть доля истины — но лишь доля. Да, на сегодняшний день нельзя полностью уничтожить вирус в организме. Но можно подавить его деятельность настолько, что проявления не будут вас беспокоить. Лечение обычно комбинированное, используются противовирусные препараты, средства, укрепляющие иммунитет, используются также физиотерапевтические методы (озонотерапия и другие), а при обострении — местные обезболивающие и противовирусные средства.
Диагностировать и лечить герпес необходимо, и это особенно важно для тех, кто готовится стать родителями. Взрослым вирус герпеса причиняет дискомфорт, но для новорожденных детей он может быть смертельно опасным.
Этапы диагностики
Диагностика герпеса разделяется на два этапа — врачебный осмотр и лабораторные исследования, цель которых — найти и идентифицировать вирус герпеса в крови и других биоматериалах.
Зачастую уже при осмотре доктор в состоянии определить, с каким именно типом герпеса он имеет дело. Однако визуальные признаки могут ввести в заблуждение, например, генитальный герпес может походить на сифилис, а для некоторых типов герпеса внешние проявления вообще не характерны. Поэтому врач обязательно направит вас на анализы на герпес.
Лабораторные методы — основа диагностики герпеса. Они позволяют определить наличие вируса даже с том случае, если он неактивен, а также установить тип возбудителя и его концентрацию.
Когда могут быть назначены анализы
Анализы на герпес следует сдавать регулярно, даже если никаких проявлений болезни нет, — это нормальная мера контроля состояния здоровья. Но в некоторых случаях анализы на герпес обязательны.
- во время планирования и ведения беременности;
- перед подготовкой к трансплантации органов;
- при появлении на коже пузырьков и высыпаний, причину которых сложно определить во время осмотра.
Методы лабораторной диагностики герпеса
Лабораторная диагностика герпеса включает в себя несколько видов анализов. Какой анализ на герпес необходим в каждом конкретном случае, решает лечащий врач. Иногда для полной уверенности потребуется пройти несколько разных исследований.
Классические методы
-
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
. Доступный и чрезвычайно простой метод, который позволяет быстро выявить вирус даже в том случае, если его концентрация в крови крайне мала. Методом ПЦР можно исследовать практически любой биоматериал. В основе ПЦР лежит метод многократного копирования части ДНК возбудителя болезни и последующей идентификации вируса и его типа. -
Иммуноферментный анализ (ИФА)
. При помощи этого метода можно выявить наличие антител IgM и IgG (качественный ИФА) и подсчитать их концентрацию (количественный ИФА). При обострении высоко содержание IgM, а в хронической стадии — IgG. Таким образом, этот способ дает возможность установить фазу болезни. -
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
. При этом методе биоматериал обрабатывается особым веществом, под воздействием которого антигены начинают светиться и их можно быстро обнаружить при микроскопическом исследовании. Этот способ хорошо работает в том случае, если концентрация возбудителя в крови высока.
Дополнительные методы диагностики
-
Культуральный метод
. Точный и надежный метод, единственным существенным минусом которого является долгое ожидание результатов. При исследовании культуральным методом биоматериал переносится на питательную среду. Вирус начинает активно захватывать здоровые клетки и исследователь, наблюдая за их изменениями, получает возможность идентифицировать вирус. Ложноположительный или ложноотрицательный результат при использовании культурального метода почти исключен, но результата приходится ждать 1–2 недели. -
Серологический метод
. Самый распространенный и доступный метод диагностики герпеса, определяющий антитела класса G. Часто назначают при подозрении на герпес 2-го типа (генитальный герпес). Биоматериалом для этого исследования является кровь из вены. -
Иммунограмма
. Это не столько анализ на герпес или какой-либо другой вирус, сколько проверка работы иммунной системы. Специалист исследует кровь из вены и определяет общее количество иммунных клеток, а также их соотношение. Этот анализ позволяет определить, каких иммуноглобулинов не хватает. Иммунограмму назначают для подбора правильной терапии для стимуляции защитной системы организма. -
Дот-гибридизация
. Метод, во многом похожий на ПЦР — он также направлен на выявление ДНК возбудителя. Способ диагностики можно использовать даже тогда, когда внешних проявлений болезни еще нет. -
Вульвокольпоцервикоскопия
. Этот метод относится к качественным и применяется для диагностики генитального герпеса у женщин. Врач осматривает слизистые оболочки влагалища и шейки матки при помощи специального микроскопа — он дает не очень большое увеличение, однако этого достаточно для того, чтобы увидеть характерные для герпеса высыпания.
Сколько стоит анализ на герпес?
Стоимость анализов на герпес значительно различается в разных частных лабораториях Москвы, поэтому мы приводим средние расценки.
ПЦР-анализ обойдется примерно в 900–1500 рублей, если анализ проводится на все типы герпеса, и в 300–500 рублей, если анализ проводится на какой-то один тип. ИФА стоит в среднем 750–900 рублей, РИФ — 450–700 рублей.
К стоимости самого анализа нужно добавить и стоимость забора биоматериала — в среднем 200–300 рублей за забор крови и 300–400 рублей за забор мазка.
Традиционный список анализов при герпесе включает в себя ПЦР, ИФА и РИФ. Дополнительные исследования назначаются в том случае, если даже эти три метода в совокупности дали неоднозначный результат, что бывает достаточно редко.
Источник
Проблеме диагностики герпесвирусных инфекций посвящено множество научных публикаций, однако в последнее время все более возрастает интерес к этому вопросу со стороны клиницистов разных специальностей. По данным литературы, вирусом простого герпеса инфицировано 65-90 % взрослого и детского населения планеты. Местом локализации первичной герпесвирусной инфекции чаще всего является слизистая оболочка полости рта.
Несмотря на широкое и разностороннее изучение данной патологии, отмечается тенденция к росту распространенности герпетических стоматитов, особенно среди детского населения. Наделю герпетической инфекции среди всех поражений слизистой полости рта у детей приходится около 80 %, у 8-20% пациентов заболевание принимает рецидивирующий характер. При этом вирус может поражать практически все органы и ткани человеческого организма. У детей грудного и раннего возраста, после исчезновения антител, полученных интерплацентарно от матери, герпетическая инфекция, как правило,протекает в виде острого герпетического стоматита. Хроническая герпетическая инфекция в полости рта проявляется в виде рецидивирующего герпетического стоматитаили герпеса губ.
Современные наблюдения специалистов позволяют говорить о изменении клинической картины герпетического стоматита и выделении атипичных форм заболевания, а именно геморрагической, геморагически-некротической, язвенной, отечной, элефанзиазоподобной, рупеоидной, зудящей, эритематозной и папулезной, герпетиформной экземы Капоши, генерализованного герпеса. В литературе упоминается импетигоподобная форма герпеса, при которой высыпания на слизистой оболочке полости рта сочетаются со стрептококковым импетиго в периоральной зоне. Атипичные формы заболевания затрудняют диагностику. Таким образом, высокая инфицированность населения и распространенность заболевания, наличие атипичных форм и отсутствие четких диагностических алгоритмов свидетельствуют об актуальности этой проблемы.
Материалом для исследования при герпетической инфекции полости рта являются:
Соскоб и мазок-отпечаток с элементов поражения, слюна, кровь.
На сегодняшний день существует большое количество лабораторных методов диагностики герпесвирусных инфекций.
Выделяют три основных диагностических подхода:
1). изоляция и идентификация вирусаиз клинического материала;
2). непосредственное исследование материала на наличие вируса, вирусного антигена или нуклеиновых кислот
3). серологическая диагностика, основанная на установлении значительного прироста вирусных антител в течение болезни.
«Золотым стандартом» диагностики вирусных заболеваний является вирусологический метод. Сущность метода состоит в выделении вируса в культурах клеток и куриных эмбрионах. Достоинствами метода являются его высокая чувствительность (85-100%) и специфичность (100%). Однако метод является дорогостоящим, трудоемким, его проведение требует специального оборудования и условий, высокой квалификации персонала. Результаты вирусологического исследования получают через 2-20 дней, что препятствует внедрению метода в повседневную клиническую практику. Чувствительность метода зависит от времени, прошедшего с момента забора материала до посева, качества забора материала, условий транспортировки, качества используемых сред и реагентов. Вирусологическое исследование является практически бесполезным спустя 5 суток после появления элементов высыпания. Современные авторы указывают на необходимость подтверждения результатов вирусологического исследования другими методами, в частности серологическими и молекулярно-генетическими. Однако метод позволяет не только получить чистую культуру вируса, но и оценить его чувствительность к противовирусным препаратам.
В настоящее время применяется ускоренный вирусологический метод выявления вирусов. При этом методе материал, полученный от больных, культивируется совместно с культурой клеток Vero в течение 24-х часов. После предварительной обработки применяется реакция непрямой иммунофлюорисценциии результаты оценивают под люминисцентным микроскопом.Этот метод позволяет выбрать антивирусный препарат для лечения герпетической инфекции и оценить эффективность противовирусной терапии через 1,5-2 месяца после окончания лечения. Результаты обследования готовы через 2-е суток.
Биологическая проба состоит в заражении чувствительных лабораторных животных (белых мышей или кроликов) биоматериалом, полученным от больного. Метод рекомендуют использовать в спорных случаях герпесвирусной инфекции и для диагностики атипичных форм.
Вирусологические исследования нашли применение в стоматологической практике. Так, выделение вируса в культуре клеток и на мышахприменялось для оценки эффективности препарата «Виферон» при лечении острого герпетического стоматита у детей. Биологическая проба так же применялась для изучения течения герпетической инфекции под влиянием разных методов лечения в экспериментальном исследовании на морских свинках.
Микроскопические методы исследования герпеса:
включают цитологическую диагностику и электронную микроскопию. Исследуемый материал для микроскопических методов получают путем соскоба или мазка-отпечатка с пораженных участков слизистой и кожи.
Цитологический метод позволяет оценить морфологические, тинкториальные особенности клеток и их компонентов, определить стадию развития элементов поражения при герпетической инфекции. При исследовании препаратов-отпечатков с элементов поражения у пациентов с герпетическим стоматитом выделяют следующие морфологические стадии развития: дегенерации или типичных клеточных повреждений, дегенерации и неспецифического воспаления, регенерации, эпителизации. На стадии дегенерации или типичных поражений клетки под микроскопом нередко можно увидеть эпителиоциты с характерными признаками, которые определяют как клетки Тцанка. Цитологические изменения заключаются в формировании гигантских многоядерных клеток округлой или неправильной формы с цитоплазмой голубого или фиолетового цвета. Количество ядер в таких клетках – 2 и более. Гигантские многоядерные клетки являются патогномоничными для вирусных заболеваний кожи и слизистых оболочек. Их выявляют при простом герпесе, а так же кори, ветряной оспе, опоясывающем лишае и других вирусных поражениях.В некоторых случаях в гигантских многоядерных клетках определяются внутриядерные включения, которые многие авторы называют тельцами Каудри. E. V. Cowdry предложил разделить внутриядерные включения на два типа: А — характеризующиеся общей реакцией всего ядра при наличии одного крупного включения и В — при ограниченной реакции ядра, когда включения представляются в виде маленьких «капелек» в ядерной массе. Однако, по мнению автора, во многих случаях включения типа В лишь соответствуют определенной стадии образования включений типа А. Единого мнения в отношении природы этих образований не существует. Одни исследователи считают, что отмеченные включения являются случайными артефактами при применении кислых фиксаторов, другие считают внутриядерные включения Каудри типа А специфическим материалом, связанным с репродукцией вируса герпеса. По мнению этих исследователей, включения состоят из тонкого гранулярного материала с пучками фибриллярных структур, вирусных частиц, мембранных осколков. Гигантские многоядерные клетки выявляют при остройи хронической рецидивирующей инфекции. В то время как внутриядерные включения, по мнению некоторых авторов, определяются только при повторных поражениях.
Цитологический метод простой, доступный, рассматривается как экспресс-метод, так как результаты исследования получают через 2-3 часа. Его чувствительность и специфичность не превышают 70-75 %. Метод нашел широкое применение в стоматологической практикедля проведения дифференциальной диагностики в сложных случаях и оценки эффективности лечебных мероприятий.
К методам экспресс-диагностики герпеса относится:
Электронная микроскопия. Метод позволяет выявить вирусные частицы в исследуемом образце. Для успешного определения вируса его концентрация в пробе должна быть примерно 1ˑ10 6 частиц в 1 мл. Но поскольку концентрация возбудителя в материале обычно незначительна, то требуется предварительное центрифугирование. Однако метод электронной микроскопии не позволяет дифференцировать вирусы простого герпеса и ветряной оспы, цитомегалии, поскольку они морфологически практически одинаковы. Использование метода ограничивается его трудоемкостью, малодоступностью, дороговизной, поэтому он применяется в основном в научных целях. Для получения результатов метода электронной микроскопии необходимо около 3-х часов, чувствительность метода составляет 70 %, специфичность около 100 %.
В настоящее время главенствующую роль в верификации герпесвирусных инфекций играют методы ДНК-диагностики, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ДНК-гибридизация.
Гибридизация ДНК – высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его специфического связывания (гибридизации) с меченой комплементарной молекулой ДНК-диагностикума. В качестве маркера применяют ферменты (пероксидазу, щелочную фосфатазу) и изотопы. Недостатком метода является его длительное время выполнения- в среднем 5-7 суток, а также высокая частота ложноотрицательных результатов при низком количестве вирусной ДНК в исследуемой пробе.
Наиболее широко используемым методом диагностики герпетической инфекции является полимеразная цепная реакция (ПЦР), предложенная Мюллисом в 1983 году. В основе метода лежит катализируемая ферментом ДНК-полимеразой многократное образование копий (ампликация) определенного участка ДНК, представляющего диагностический интерес. Для ампликации отбирают уникальный ген, который наиболее четко отличает определяемый патоген от прочих.
Различают качественный, полуколичественный и количественный варианты метода. При проведении качественной ПЦР определяют лишь факт присутствия вируса, однако не возможным является оценка его репродуктивной активности, что не позволяет провести дифференциальную диагностику между латентными, персистирующими и реактивными формами инфекции. Полуколичественная ПЦР дает информацию о содержании копий вирусных ДНК в виде условных обозначений (+, ++, +++, ++++). Методом, позволяющим получить числовые значения, отражающие репродуктивную активность вируса является количественная ПЦР. Полученный количественный результат не соответствует истинному содержанию ДНК возбудителя в исследуемой пробе. При этом существует определенная пропорциональность между исходным количеством ДНК вируса и конечным результатом исследования. Такая пропорциональность соблюдается лишь при проведениидиагностики в стандартных условиях с использованием одних и тех же реактивов, поэтому сравнительный анализ полученных результатов в динамике проводят при обследовании пациента в одной лаборатории.
Ложноотрицательные результаты возможны при несоблюдении технологий и использовании некачественных реактивов. Ложноположительные данные возможны при подсчете результатов методом электрофореза, что обусловлено контаминацией воздушной среды рабочего пространства ампликонами при предварительных постановках, поэтому используют открытые методики подсчета результатов с надлежащей вентиляцией помещений и закрытые, которые являются более предпочтительными, так как предполагают отсутствие прямогоконтактамежду продуктами реакции и воздушной средой.
Наиболее точной является методика ПЦР в реальном времени (real time ПЦР). Ее особенностью является подсчет количества амплифицированных ДНК по мере их накопления после каждого цикла, а не в конце постановки ПЦР.
Даже количественная ПЦР не всегда позволяет отдифференцировать латентную и реактивированную инфекции. В этом случае рекомендуют использовать ПЦР обратной транскрипции, с помощью которой подсчитывают количество вирусной м-РНК, которое свидетельствует об интенсивности экспрессии вирусных генов. ПЦР является точным методом, так как для получения результата достаточно иметь в пробе всего одну молекулу ДНК возбудителя. Чувствительность ПЦР составляет 98%, а специфичность – 94 %. РезультатыПЦР можно получить уже через 3-6 часов после начала проведения.В стоматологической практике ПЦР широко применяется в диагностических целях. Установлена зависимость уровня вирусной активности в ротовой жидкости от степени тяжести герпетической инфекции.
Определения вирусных антигенов возможно при помощи реакции иммунофлюорисценции.
Этот метод основан на использовании иммуноглобулинов, меченных красителями и дающих зеленовато-желтую или красную флюорисценцию. Результаты метода учитывают при люминисцентой микроскопии препаратов обработанных меченными антителами. Метод иммунофлюорисценции используют в двух вариантах: прямой (ПИФ) и непрямой (НИФ). При прямом методе красителями метят антитела, непосредственно взаимодействующие с антигеном. При непрямом методе с исследуемым антигеном взаимодействуют специфические антитела, а уже с ними антивидовые антитела, меченые флюорохромом. Эти методы в какой то мере дублируют результаты ПЦР и могут быть полезны для исключения ложноположительных или ложноотрицательных результатов ДНК-диагностики. Чувствительность метода – 55-75 %, специфичность – 90 %. Метод нашел широкое применение в стоматологической практике для уточнения диагноза.
Серологические методы диагностики герпеса:
(реакции нейтрализации, связывания комплемента, гемагглютинации, иммунофлюорисценции и др.) позволяют оценить характер и напряженность специфического гуморального иммунитета. Все эти методы позволяют с разной степенью достоверности установить факт инфицирования пациента с вирусом. Диагностика основывается на наличии противогерпетическихIg M и Ig G. Наличие специфического Ig M свидетельствует об остроте процесса (первичная инфекция, реинфекция, реактивация). При первичной герпесвирусной инфекции противогерпетический Ig M появляется на 7-14 сутки после инфицирования и циркулирует 1-3 месяца. У отдельных лиц может сохраняться на протяжении длительного времени, давая ложную информацию об остроте процесса. Противогрепетические Ig G являются антителами вторичного иммунного ответа. При первичной инфекции выявляются во второй половине инфекционного процесса, а также при латентной, персистирующей инфекции и реактивации вируса. Рекомендуют применять метод парных сывороток, оценивая титр специфических антител с промежутком в 2-3 недели. Однако четырехкратное повышение титра специфическогоIg G является диагностическим критерием лишь при первичном инфицировании. Проведение серологических исследований позволяет оценить иммунный статус организма. Так, расхождение между показателями ПЦР, свидетельствующими о высокой репродуктивнойактивности вируса, и данными серологических исследований, показывающими низкий титр специфических антител, свидетельствует о недостаточности специфического гуморального иммунного ответа и является показанием к назначению заместительной терапии (препаратов специфических иммуноглобулинов) или средств, повышающих антителогенез (полиоксидоний, спленин и др.).
Иммунологические исследования являются обязательными при манифестных формах инфекции, так как вирус способен оказывать иммуносупрессивное действие на зараженный организм. Результаты таких исследований позволяют выявить иммунный дефект и назначить рациональную терапию. Метод применяется для выбора средств иммунотерапии и оценки их эффективности при лечении герпетических стоматитов.
Таким образом, диагностическими критериями герпетической инфекции полости рта являются:
-выявление вирусных агентов в крови, слюне, соскобах и мазках-отпечатках с элементов поражения достоверными методами: ПЦР, методом иммунофлюорисценции;
— в спорных случаях для экспресс-диагностики необходимо проводить цитологическое исследование с целью выявления клеток Тцанка;
— для диагностики первичной герпетической инфекции важным является выявление вирус-специфических иммуноглобулинов M и G.
При постановке диагноза обязательно учитывают наличие клинических признаков герпетической инфекции (типичных элементов поражения).
Для назначения рациональной противовирусной и иммунотерапии рекомендуется проведение следующих исследований:
— определение противогерпетических антител классаM, G и А для оценки напряженности специфического гуморального иммунитета;
— иммунологическое исследование проводят при тяжелом или атипичном течении и частых рецидивах герпетической инфекции, при низкой чувствительности к лечению ацикловиром и его аналогами.
Источник
