Нодулярный дерматит крс пцр диагностика

Описание
Характеристики
Принцип работы
Подтверждение качества

Тест-система «ГенТест Нодулярный дерматит» предназначена для выявления ДНК Lumpy skin disease virus методом полимеразной цепной реакции c детекцией результатов в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) в лабораторной ветеринарной практике.

Отличительные особенности набора «ГенТест Нодулярный дерматит»:

• Высокочувствительность, лимит детекции составляет 3 геном-эквивалента возбудителя в реакции ПЦР-РВ;
• Фермент урацил-ДНК-гликозилазу (УДГ) и дУТФ в составе, что позволяет избежать контаминации ПЦР-смеси продуктами предшествующих ПЦР и получения ложноположительных результатов;
• Снижен риск ошибки оператора на всех этапах работы за счет использования идентичных и простых протоколов тест-систем серии «ГенТест»;
• Простота работы: минимальное количество манипуляций как на стадии выделения ДНК, так и при постановке ПЦР, что значительно упрощает работу оператора и увеличивает поточность проводимых исследований;
• Высокая скорость анализа: от поступления пробы до результата затрачивается не более 80 мин, благодаря использованию экспресс метода выделения ДНК и ДНК-полимеразы нового поколения;
• Низкая себестоимость анализа: большая экономия из-за существенного сокращения самой трудоемкой стадии анализа — выделения ДНК. Более того, сокращается потребление расходных материалов (пробирок, наконечников);
• Качественная техническая поддержка: консультация специалистов по всем возникающим вопросам.

Инструкция к тест-системе «ГенТест Нодулярный дерматит»

Комплектации тест-системы «ГенТест Нодулярный дерматит» указаны в таблице 1.

Таблица 1. Состав набора «ГенТест Нодулярный дерматит»:

Для этапа экстракции ДНК из образца рекомендуется использование реагентов: «АртДНК Экспресс», «АртРНК экстракт», «АртДНК легкий» или «АртРНК магнит».
Результат амплификации ДНК возбудителя регистрируется на канале HEX/Yellow, результат амплификации внутреннего контроля регистрируется на канале FAM/Green.

Размеры упаковки:

• маленькая: 9,5 × 5,5 × 2,5 см
• большая: 11,5 × 9,5 × 4,5 см

Меры предосторожности:

При работе с тест-системой необходимо соблюдать текущие ТНПА в области лабораторной ветеринарной ПЦР-диагностики.

Транспортировка и хранение набора:

Немаловажным фактором, влияющим на качество, является соблюдение норм транспортировки и хранения.
Компания Альгимед осуществляет транспортировку и хранение тест-систем соблюдая требования и правила производителя, в том числе и такие как рекомендованный температурный режим.

Транспортировка: при температуре +2 – +8 оС в течение не более 30 суток или при температуре менее 30 °С в течение суток. Тест-системы «ГенТест Нодулярный дерматит» транспортируют любым видом транспорта в условиях, обеспечивающих их сохранность, в соответствии с правилами перевозки грузов, действующими на данном виде транспорта.
Хранение: в упаковке изготовителя при температуре от минус 24 °С до минус 16 °С. Допускается хранение всех компонентов набора при температуре +2 – +8 °С в течение 90 дней. Допускается заморозка/оттаивание компонентов тест-системы до 10 раз. Срок годности тест-системы «ГенТест Нодулярный дерматит» – 12 месяцев с даты изготовления.

I. Оборудование и материалы:

ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах). Для работы требуются следующие материалы и оборудование.
ЗОНА 1 – Для экстракции ДНК из исследуемого материала. Оборудуется в соответствии с критериями фирмы-производителя наборов для выделения ДНК.
ЗОНА 2 – Для проведения амплификации ДНК:

• амплификатор с детекцией результатов в режиме «реального времени»;
• ПЦР-бокс;
• центрифуга/вортекс;
• набор дозаторов переменного объема;
• одноразовые наконечники с фильтром для дозаторов переменного объема;
• одноразовые полипропиленовые закрывающиеся пробирки объемом 1,5–2,0 мл;
• оптические пробирки для ПЦР-РВ, адаптированные для используемого амплификатора;
• штативы для пробирок и наконечников;
• холодильник от +2°С до +8°С с морозильной камерой от минус 24°С до минус 16°С;
• отдельный халат и одноразовые перчатки;
• емкость для сброса наконечников;
• комплект средств для обработки рабочего места.

II. Проведение анализа:

1. Выделение ДНК
Производится совместно с ВКО (10 мкл на выделение) в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя реагентов для очистки ДНК.

2. Подготовка ПЦР-смеси

• Разморозить все реагенты (при необходимости), перемешать (перевернув пробирки несколько раз) и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
• В каждую постановку амплификации помимо исследуемых образцов (N) должны входить 3 контрольных образца: отрицательный контроль ПЦР (К-), положительный контроль ПЦР (К+), отрицательный контроль экстракции (ОКЭ).
  В пробирке объемом 1,5-2 мл приготовить «Мастер Микс»:

  10*(N+1) мкл ПЦР-реагента + 10*(N+1) мкл праймеров

  где N — общее количество реакций амплификации с учетом контрольных образцов. Допускается
  округление значений в большую сторону.

• Перемешать «Мастер Микс» путем 5-ти кратного переворачивания пробирки, осадить
  кратковременным центрифугированием и внести по 20 мкл в пробирки для проведения ПЦР.
• Используя наконечник с фильтром в подготовленные пробирки добавить по 10 мкл ДНК
  исследуемых образцов.
• Поставить контрольные реакции амплификации:

  1) К- – внести в пробирку 10 мкл ОКО;
  2) К+ – внести в пробирку 10 мкл ПКО;
  3) ОКЭ – внести в пробирку 10 мкл ОКЭ.

  Герметично закрыть пробирки крышками. В случае наличия пузырьков в растворе или капель на стенках пробирок – удалить кратковременным центрифугированием.

3. Постановка реакции амплификации

• Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в амплификатор.
• В соответствии с инструкцией к прибору, запрограммировать амплификатор согласно таблице 2.

Таблица 2. Параметры амплификации:

• В соответствии с инструкцией к прибору запрограммировать положение пробирок в амплификаторе. Также допускается выполнять данный шаг во время проведения амплификации или по ее окончанию, если это позволяет ПО прибора.
• Дать название эксперименту и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента). Запустить амплификатор*.

*Для приборов «Rotor-Gene» перед запуском выбрать функцию: «Perform Calibration Before 1st Acquisition/Perform Optimization Before 1st Acquisition/Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Для обоих каналов установить параметры «Min Reading/Миним. Сигнал» – 5Fl и «Max Reading/Максим. Сигнал» – 10Fl.

III. Анализ результатов:

1. Перед началом анализа необходимо задать настройки в соответствии с инструкцией к прибору.
а) для приборов типа «Rotor-Gene»:

• активировать функции «Dynamic tube/Динамич.фон» и «Slope Correct/Коррек. Уклона»;
• установить значение параметра выбросов («NTC threshold/Порог Фона») – 10%. При необходимости порог фона может быть изменен в диапазоне 0–30 %*;
• установить значение параметра пороговой линии («Threshold/Порог») – 0,02. При необходимости порог может быть изменен в диапазоне 0,02–0,2*.

б) для приборов «Bio-Rad CFX96»:

• активировать функции «Apply Fluorescence Drift Correction» и «Baseline Subtracted Curve fit»;
• установить значение параметра пороговой линии («Single Threshold») – 50. При необходимости порог может быть изменен в диапазоне 25–250*.

в) для прочих амплификаторов:

• в инструкции приведены рекомендации по наиболее распространённому оборудованию. В случае необходимости, разработчик предоставляет методические указания по работе тест-системы на амплификаторах, отличных от описанных.

*В зависимости от установленной версии программного обеспечения названия команд могут несколько отличаться.
**Необходимость корректировки выбросов возникает в случаях сильных колебаний флуоресценции в отдельных пробах.

2. Выбрать логарифмическую шкалу для отражения результатов и визуально проконтролировать пересечение пороговой линии в линейной части роста кривой амплификации. При пересечении пороговой линии с кривой амплификации не в линейном участке – переместить ее вручную до необходимого уровня.
Результаты анализа интерпретируются на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (что соответствует наличию/отсутствию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов).

3. Удостовериться, что ПЦР-исследование валидно: контрольные точки анализа должны соответствовать значениям, приведенным в таблице 3.
В случае не соответствия контрольных точек требуемым значениям – анализ необходимо переделать начиная со стадии экстракции ДНК.

Таблица 3. Оценка результатов анализа контрольных точек:

4. Интерпретировать результаты ПЦР-анализа исследуемых образцов в соответствии с таблицей 4.

Таблица 4. Интерпретации результатов образцов:

«–» обозначает отсутствие значения «Сt», график амплификации не пересекает пороговую линию
«+» обозначает наличие значения «Сt», график амплификации пересекает пороговую линию
«+/–» – значение «Сt» для данного канала не анализируется

5. В случае невалидного образца требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего
образца, начиная с этапа экстракции ДНК.

IV. Проблемы при работе и методы их устранения:

Таблица 5. Проблемы при работе и методы их устранения:

* Для приборов Rotor-Gene допустимо использование ПЦР пробирок фирмы-производителя прибора (Qiagen, кат. номер 981005, 981008, 981103, 981106 и др.), а также адаптированный пластик (Axygen, кат. номер PCR-0104-C).

Тест-система имеет Декларацию о соответствии, выданную в Российской Федерации.
Каждая тест-система в комплекте поставки содержит Сертификат качества от производителя.