Нодулярный дерматит крс пцр диагностика

Нодулярный дерматит крс пцр диагностика thumbnail

При несоблюдении санитарных норм содержания КРС возможно заражение животных разного рода инфекционными заболеваниями. Это, в свою очередь, приводит к падению продуктивности, падежу скота, а, следовательно, и к снижению рентабельности ферм. Болезней, поражающих именно КРС, существует множество. При этом одной из самых опасных является нодулярный дерматит.

Нодулярный дерматит крупного рогатого скота (кожная бугорчатка, кожно-узелковая сыпь, узелковая экзантема), болезнь «кожного отека» у буйволов (Dermatitis nodularis bovum) — инфекционная болезнь крупного рогатого скота, сопровождающаяся лихорадкой, отеком подкожной соединительной ткани и органов, образованием кожных узлов, поражением глаз, слизистой оболочки дыхательного и пищеварительного трактов.

Болезнь эта относительно новая. В нашей стране впервые заболевшие нодулярным дерматитом животные были выявлены на территории Чечни в 2015 г., осенью. Совсем недавно, в начале июня 2016 г. заболевание было обнаружено в Краснодарском крае. Имеются также сведения об инфицированных ранее животных в Дагестане, Южной Осетии и Азербайджане.

12

Происходит заражение КРС нодулярным дерматитом при попадании в организм животных ДНК-содержащих вирусов Neethling, Allerton или BLD. Репродуцируется этот вирус в почечной или тестикулярной ткани. Его опасность заключается, помимо всего прочего, в том, что он способен выдерживать до 3 циклов замораживания. При температуре в 4 градуса он может сохранять жизнеспособность в течение 6 месяцев.

Источники заражения

Больные животные и вирусоносители выделяют вирус с кровью, слюной, молоком, спермой, отмершей кожей узелков. Сперма быков содержит его еще два месяца после излечения, узелки у всех животных – до четырех месяцев. Инфекция передается посредством кровососущих насекомых. К ним относятся москиты, комары, мухи. Есть предположения о переносе вируса водоплавающими птицами. Известны случаи заражения животных, находящихся на расстоянии сотен километров. При этом близкие особи, из одного с зараженным стада, оставались здоровыми.

57

Симптомы

Инкубационный период болезни может длиться от 3 до 30 дней. Поскольку в этот период нодулярный дерматит никак себя не проявляет, животные не изолируются. А следовательно, значительно возрастает риск распространения инфекции.

Проявляться болезнь может в двух формах: острой и хронической. Известен также атипичный нодулярный дерматит. При острой форме у заболевшего животного резко поднимается температура тела (до 40 градусов). При этом у животного снижается аппетит, текут слезы и появляются слизистые выделения из носа. Через двое суток на коже животного образуются узелки диаметром от 0.5 до 7 см и высотой до 0.5 см. Количество их может колебаться от 10 до нескольких сотен. В некоторых случаях они сливаются.

На ощупь узелки плотные. Через несколько часов по их контуру начинает отслаиваться эпидермис. При этом в центре каждого узелка образуется ямка. С нее начинает распространяться некроз. Пораженные места окаймлены валиком из грануляционной ткани шириной до 3 мм. Через неделю некротизированный участок, имеющий форму цилиндра размером примерно 1*2 см, подсыхает и отпадает. В последующем образовавшаяся на коже животного полость заполняется тканью и зарастает лишенной пигмента кожей с шерстью. Но происходит так только в случае отсутствия осложнений. Бывает и так, что на коже животного образуются язвы. Некоторые узелки могут не отсыхать по году и более.

Помимо кожных образований, нодулярный дерматит крупного рогатого скота характеризуют следующие симптомы:

  • Розовый цвет молока. Сдаивается оно очень тяжело — по каплям. При нагревании молоко зараженного животного приобретает гелеобразный вид. Скармливать его телятам можно после пастеризации при температуре 85 градусов в течение получаса.
  • Исхудание животного вследствие потери аппетита.
  • Появление на веках коровы или быка язвочек или эрозии.
  • Текущая слюна изо рта и гнойная зловонная слизь из носа.
  • Помутнение роговицы и снижение зрения у животного.

6

Иногда изъязвления появляются и в дыхательных путях коровы либо быка. В этом случае животное может погибнуть от удушья.

Атипичная форма нодулярного дерматита протекает без образования узелков. Проявляется она только у новорожденных телят.

Читайте также:  Атопический дерматит у детей формы по возрастам

Как савится диагноз

Определяют заражение, прежде всего на основе общей клинической картины. Помимо этого, проводится и лабораторная диагностика заболевания.

Симптомы нодулярного дерматита схожи с проявлениями крапивницы, дерматофилеза, оспы, демодекоза и лимфонгита. Иногда эту болезнь путают даже с банальными укусами насекомых. Поэтому при появлении на коже животных каких-либо узелков проводить лабораторные исследования стоит обязательно.

Наша лаборатория приобрела набор «ПЦР НОДУЛЯРНЫЙ ДЕРМАТИТ КРС ФАКТОР» с помощью которого анализ на заболевание проводится в среднем в течение 4 – х часов с момента поступления материала для исследования.

Подробнее об отборе и транспортировке материала здесь.

Какой ущерб может нанести болезнь

Нодулярный дерматит крупного рогатого скота, лечение которого, к сожалению, не проводится, может поражать от 5 до 50% животных стада. Иногда случается и так, что болезнь затрагивает и 100% КРС. Падеж из-за инфицирования обычно составляет не более 10%, а чаще всего от 1 до 5%.

Хотя эта болезнь не «выкашивает» стадо целиком, относят ее к одной из самых опасных. Дело в том, что при ее распространении значительно снижается продуктивность животных. При этом фермеры несут значительные убытки на продаже как молока, так и мяса, а также шкур. Крайне негативно это заболевание сказывается и на размножении КРС. Инфицированные быки становятся временно стерильными. У заболевших же коров нарушается половая цикличность. У беременных животных случаются аборты.

Источник

Описание
Характеристики
Принцип работы
Подтверждение качества


Тест-система «ГенТест Нодулярный дерматит» предназначена для выявления ДНК Lumpy skin disease virus методом полимеразной цепной реакции c детекцией результатов в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) в лабораторной ветеринарной практике.

Отличительные особенности набора «ГенТест Нодулярный дерматит»:

  • Высокочувствительность, лимит детекции составляет 3 геном-эквивалента возбудителя в реакции ПЦР-РВ;
  • Фермент урацил-ДНК-гликозилазу (УДГ) и дУТФ в составе, что позволяет избежать контаминации ПЦР-смеси продуктами предшествующих ПЦР и получения ложноположительных результатов;
  • Снижен риск ошибки оператора на всех этапах работы за счет использования идентичных и простых протоколов тест-систем серии «ГенТест»;
  • Простота работы: минимальное количество манипуляций как на стадии выделения ДНК, так и при постановке ПЦР, что значительно упрощает работу оператора и увеличивает поточность проводимых исследований;
  • Высокая скорость анализа: от поступления пробы до результата затрачивается не более 80 мин, благодаря использованию экспресс метода выделения ДНК и ДНК-полимеразы нового поколения;
  • Низкая себестоимость анализа: большая экономия из-за существенного сокращения самой трудоемкой стадии анализа — выделения ДНК. Более того, сокращается потребление расходных материалов (пробирок, наконечников);
  • Качественная техническая поддержка: консультация специалистов по всем возникающим вопросам.

Инструкция к тест-системе «ГенТест Нодулярный дерматит»

Комплектации тест-системы «ГенТест Нодулярный дерматит» указаны в таблице 1.

Таблица 1. Состав набора «ГенТест Нодулярный дерматит»:

Компонент

Объем, не менее
на 55 реакций на 110 реакций
1. ПЦР-реагент 1 пробирка – 550 мкл 1 пробирка – 1,1 мл
2. Праймеры НД 1 пробирка – 550 мкл 1 пробирка – 1,1 мл
3. ПКО 1 пробирка – 0,5 мл 1 пробирка – 0,5 мл
4. ОКО 1 пробирка – 1,0 мл 1 пробирка – 1,0 мл
5. ВКО2 1 пробирка – 550 мкл 1 пробирка – 1,1 мл

Для этапа экстракции ДНК из образца рекомендуется использование реагентов: «АртДНК Экспресс», «АртРНК экстракт», «АртДНК легкий» или «АртРНК магнит».
Результат амплификации ДНК возбудителя регистрируется на канале HEX/Yellow, результат амплификации внутреннего контроля регистрируется на канале FAM/Green.

Размеры упаковки:

  • маленькая: 9,5 × 5,5 × 2,5 см
  • большая: 11,5 × 9,5 × 4,5 см

Меры предосторожности:

При работе с тест-системой необходимо соблюдать текущие ТНПА в области лабораторной ветеринарной ПЦР-диагностики.

Транспортировка и хранение набора:

Немаловажным фактором, влияющим на качество, является соблюдение норм транспортировки и хранения.
Компания Альгимед осуществляет транспортировку и хранение тест-систем соблюдая требования и правила производителя, в том числе и такие как рекомендованный температурный режим.

Читайте также:  Какие препараты принимать при себорейном дерматите

Транспортировка: при температуре +2 – +8 оС в течение не более 30 суток или при температуре менее 30 °С в течение суток. Тест-системы «ГенТест Нодулярный дерматит» транспортируют любым видом транспорта в условиях, обеспечивающих их сохранность, в соответствии с правилами перевозки грузов, действующими на данном виде транспорта.
Хранение: в упаковке изготовителя при температуре от минус 24 °С до минус 16 °С. Допускается хранение всех компонентов набора при температуре +2 – +8 °С в течение 90 дней. Допускается заморозка/оттаивание компонентов тест-системы до 10 раз. Срок годности тест-системы «ГенТест Нодулярный дерматит» – 12 месяцев с даты изготовления.

I. Оборудование и материалы:

ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах). Для работы требуются следующие материалы и оборудование.
ЗОНА 1 – Для экстракции ДНК из исследуемого материала. Оборудуется в соответствии с критериями фирмы-производителя наборов для выделения ДНК.
ЗОНА 2 – Для проведения амплификации ДНК:

  • амплификатор с детекцией результатов в режиме «реального времени»;
  • ПЦР-бокс;
  • центрифуга/вортекс;
  • набор дозаторов переменного объема;
  • одноразовые наконечники с фильтром для дозаторов переменного объема;
  • одноразовые полипропиленовые закрывающиеся пробирки объемом 1,5–2,0 мл;
  • оптические пробирки для ПЦР-РВ, адаптированные для используемого амплификатора;
  • штативы для пробирок и наконечников;
  • холодильник от +2°С до +8°С с морозильной камерой от минус 24°С до минус 16°С;
  • отдельный халат и одноразовые перчатки;
  • емкость для сброса наконечников;
  • комплект средств для обработки рабочего места.

II. Проведение анализа:

1. Выделение ДНК
Производится совместно с ВКО (10 мкл на выделение) в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя реагентов для очистки ДНК.

2. Подготовка ПЦР-смеси

  • Разморозить все реагенты (при необходимости), перемешать (перевернув пробирки несколько раз) и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
  • В каждую постановку амплификации помимо исследуемых образцов (N) должны входить 3 контрольных образца: отрицательный контроль ПЦР (К-), положительный контроль ПЦР (К+), отрицательный контроль экстракции (ОКЭ).
    В пробирке объемом 1,5-2 мл приготовить «Мастер Микс»:

    10*(N+1) мкл ПЦР-реагента + 10*(N+1) мкл праймеров

    где N — общее количество реакций амплификации с учетом контрольных образцов. Допускается
    округление значений в большую сторону.

  • Перемешать «Мастер Микс» путем 5-ти кратного переворачивания пробирки, осадить
    кратковременным центрифугированием и внести по 20 мкл в пробирки для проведения ПЦР.
  • Используя наконечник с фильтром в подготовленные пробирки добавить по 10 мкл ДНК
    исследуемых образцов.
  • Поставить контрольные реакции амплификации:

    1) К- – внести в пробирку 10 мкл ОКО;
    2) К+ – внести в пробирку 10 мкл ПКО;
    3) ОКЭ – внести в пробирку 10 мкл ОКЭ.

    Герметично закрыть пробирки крышками. В случае наличия пузырьков в растворе или капель на стенках пробирок – удалить кратковременным центрифугированием.

3. Постановка реакции амплификации

  • Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в амплификатор.
  • В соответствии с инструкцией к прибору, запрограммировать амплификатор согласно таблице 2.

Таблица 2. Параметры амплификации:

Шаг Температура, °C Время Кол-во циклов
Начальная денатурация

95

2 мин

1

Денатурация

95

5 сек

10

Отжиг

60

10 сек

Элонгация

67

10 сек

Денатурация

95

5 сек

35

Отжиг/Детекция по каналам
FAM/Green, HEX/Yellow

60

10 сек3

Элонгация

67

10 сек3

  • В соответствии с инструкцией к прибору запрограммировать положение пробирок в амплификаторе. Также допускается выполнять данный шаг во время проведения амплификации или по ее окончанию, если это позволяет ПО прибора.
  • Дать название эксперименту и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента). Запустить амплификатор*.

*Для приборов «Rotor-Gene» перед запуском выбрать функцию: «Perform Calibration Before 1st Acquisition/Perform Optimization Before 1st Acquisition/Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Для обоих каналов установить параметры «Min Reading/Миним. Сигнал» – 5Fl и «Max Reading/Максим. Сигнал» – 10Fl.

III. Анализ результатов:

1. Перед началом анализа необходимо задать настройки в соответствии с инструкцией к прибору.
а) для приборов типа «Rotor-Gene»:

  • активировать функции «Dynamic tube/Динамич.фон» и «Slope Correct/Коррек. Уклона»;
  • установить значение параметра выбросов («NTC threshold/Порог Фона») – 10%. При необходимости порог фона может быть изменен в диапазоне 0–30 %*;
  • установить значение параметра пороговой линии («Threshold/Порог») – 0,02. При необходимости порог может быть изменен в диапазоне 0,02–0,2*.

б) для приборов «Bio-Rad CFX96»:

  • активировать функции «Apply Fluorescence Drift Correction» и «Baseline Subtracted Curve fit»;
  • установить значение параметра пороговой линии («Single Threshold») – 50. При необходимости порог может быть изменен в диапазоне 25–250*.

в) для прочих амплификаторов:

  • в инструкции приведены рекомендации по наиболее распространённому оборудованию. В случае необходимости, разработчик предоставляет методические указания по работе тест-системы на амплификаторах, отличных от описанных.

*В зависимости от установленной версии программного обеспечения названия команд могут несколько отличаться.
**Необходимость корректировки выбросов возникает в случаях сильных колебаний флуоресценции в отдельных пробах.

2. Выбрать логарифмическую шкалу для отражения результатов и визуально проконтролировать пересечение пороговой линии в линейной части роста кривой амплификации. При пересечении пороговой линии с кривой амплификации не в линейном участке – переместить ее вручную до необходимого уровня.
Результаты анализа интерпретируются на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (что соответствует наличию/отсутствию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов).

3. Удостовериться, что ПЦР-исследование валидно: контрольные точки анализа должны соответствовать значениям, приведенным в таблице 3.
В случае не соответствия контрольных точек требуемым значениям – анализ необходимо переделать начиная со стадии экстракции ДНК.

Таблица 3. Оценка результатов анализа контрольных точек:

Контрольная
точка

Контролируемый
этап анализа

Значение «Сt»
по каналу
HEX/Yellow

Значение «Сt»
по каналу
«FAM/Green»

ОКЭ

Экстракция ДНК

+

К-

ПЦР

K+

ПЦР

+

+

4. Интерпретировать результаты ПЦР-анализа исследуемых образцов в соответствии с таблицей 4.

Таблица 4. Интерпретации результатов образцов:

Результат образца

Значение «Сt»
по каналу
HEX/Yellow

Значение «Сt»
по каналу
«FAM/Green»

Положительный

+

+/–

Отрицательный

+

Невалидный

«–» обозначает отсутствие значения «Сt», график амплификации не пересекает пороговую линию
«+» обозначает наличие значения «Сt», график амплификации пересекает пороговую линию
«+/–» – значение «Сt» для данного канала не анализируется

5. В случае невалидного образца требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего
образца, начиная с этапа экстракции ДНК.

IV. Проблемы при работе и методы их устранения:

Таблица 5. Проблемы при работе и методы их устранения:

Проблема

Возможная причина проблемы

Варианты решения проблемы

Нет сигнала по каналу «FAM/Green» или значение Сt>24

Использование неподходящих расходных материалов

используйте оптические пробирки для постановки ПЦР, рекомендованные фирмой-производителем амплификатора либо адаптированные для используемого прибора*

ПЦР ингибирование

разведите образец в 5 раз в воде, повторите анализ
используйте новый образец материала
используйте сорбентный метод выделения ДНК

Нет сигнала в К+

Некорректное приготовление ПЦР-смеси

аккуратно приготовьте новую ПЦР-смесь

Некорректные параметры амплификации

установите параметры амплификации в соответствии с таблицей 2

Некорректные условия хранения наборов

используйте наборы, которые хранились в надлежащих условиях

Наличие сигнала по каналу «HEX/Yellow» в К- и/или ОКЭ

Контаминация

— проведите деконтаминационные процедуры;
— используйте новые наборы

* Для приборов Rotor-Gene допустимо использование ПЦР пробирок фирмы-производителя прибора (Qiagen, кат. номер 981005, 981008, 981103, 981106 и др.), а также адаптированный пластик (Axygen, кат. номер PCR-0104-C).

Тест-система имеет Декларацию о соответствии, выданную в Российской Федерации.
Каждая тест-система в комплекте поставки содержит Сертификат качества от производителя.

Источник

Читайте также:  Стрептококковый дерматит у детей фото