Вирус герпеса и кандида

Herpes Simplex Virus (HSV) Modulation of Staphylococcus aureus and Candida albicans Initiation of HeLa 299 Cell-Associated Biofilm
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4828481/

Хотя вирусы простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) и тип-2 (ВПГ-2), Staphylococcus aureus и Candida albicans являются привычными для слизистой оболочки полости рта и полости рта, их взаимодействие плохо изучено. Мы определили влияние HSV на бактериальную и / или грибковую адгезию, начальную стадию образования биопленки. Клетки HeLa229 были инфицированы HSV-1 (KOS) gL86 или HSV-2 (KOS) 333gJ- при множественности инфекции (MOI) 50 и 10. S. aureus (ATCC 25923) и / или C. albicans (дрожжевые формы или зародышевые формы) совместно инкубировали в течение 30 минут (37 ° C, 5% CO2, 5: 1: соотношение клеток HeLa, n = 16) с инфицированными вирусом клетками HeLa или неинфицированными клетками клеток HeLa. После инкубации монослои промывали (3 раза, PBS), лизировали (RIPA) и лизат, нанесенный на агар солей Fungisel и / или маннита для стандартного количества колоний. Уровень HeLa-ассоциированного S. aureus был значительно снижен (P

Соблюдение клеточных поверхностей является существенной начальной стадией колонизации микроорганизмов и последующего образования биопленки [58, 77]. Общими участками стойкой колонизации и хронической инфекции для Staphylococcus aureus, Candida albicans и HSV являются оронасофаринкс и половые пути. S. aureus и C. albicans, оба комменсала, также являются 2-й и 4-й наиболее распространенными причинами инфекций кровотока, соответственно [54, 79]. Из различных участков совместной колонизации S. aureus и C. albicans оронасофаринкс служит резервуаром для системных инфекций [44]. Внутри oronasopharynx S. aureus, C. альбиканы и ВПГ занимают две различные географические ниши. У хозяев с зубными рядами слизистая оболочка полости рта разделяется ВПГ и C. albicans, тогда как передние носовые носы заняты S. aureus [21]. Клинически S. aureus редко выделяется из орально-глоточных образцов, когда присутствует нормальная ткань, несмотря на то, что in vitro обнаруживает, что S. aureus придерживается буккальных эпителиальных клеток [22, 51]. Интересно, что в присутствии протезов абиотическая поверхность S. aureus образует прочную биопленку на поверхности протеза вместе с C. albicans [29, 63]. Мало что известно о соколинических нишах половых путей за пределами клинических данных, что инфекция S. aureus связана с воспалением половых органов, разгрузкой и диспареунией, тогда как C. albicans и HSV продуцируют повреждения слизистой оболочки, подобные тем, которые наблюдаются в полости рта [25, 39, 46, 55, 59]. Является ли он присутствующим в oronasopharynx или генитальном тракте, является почти уверенностью, что S. aureus и C. albicans будут взаимодействовать в какой-то момент с HSV, постоянным резидентным участком инфекции [5].

ВПГ, являющаяся основной причиной заболеваемости и смертности, представляет собой пожизненный патоген, присутствующий в> 90% мирового населения [11, 71]. У иммунокомпетентных людей HSV-1 является основной причиной гингивостоматита, а также генитального герпеса из-за изменений в сексуальном поведении [5, 48]. Подобно HSV-1, HSV-2 вызывает устные поражения, хотя он имеет более высокую связь с генитальными поражениями [7, 72]. Характерной особенностью герпетических инфекций является хроническая стойкая вирусная пролиферация при отсутствии симптомов [65, 67]. Это постоянное, хотя и прерывистое, присутствие вирионов HSV может играть определенную роль в регулировании микробиома-хозяина. Это может быть достигнуто путем изменения доступных рецепторов клеточной поверхности для соблюдения другими членами микробиома. [6, 8-10, 12, 16, 19, 21, 53]. Используя модель вирусной инфекции HeLa, фокус этого исследования заключался в том, чтобы определить, влияют ли HSV-1 или HSV-2 на зародышевую трубку S. aureus и / или C. albicans и адгезию формы дрожжей, начальную стадию образования биопленки.

Использовались рекомбинантные спредочно-дефицитные, начальные штаммы HSV-1 (KOS) gL86 и HSV-2 (KOS) 333gJ-, кодирующие активность репортера бета-галактозидазы [3, 37, 68, 74]. Оба вирусных штамма вводятся и реплицируются, таким образом, обладают потенциалом для индукции клеточной передачи сигналов, но отсутствуют гены, необходимые для распространения вирусных клеток в клетках. Все вирусы, используемые в этом исследовании, были взяты из одной партии. Запасы вируса поддерживались при -80 ° C до использования. Вхождение HSV в клетки HeLa подтверждали анализами о-нитрофенил-β-d-галактопиранозида (ONPG) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-d-галактопиранозида (X-Gal), как описано ранее [52 ]. Ячейки HeLa 229 поддерживали и культивировали при 37 ° С, 5% СО2 в 1 × Dulbecco модифицированной среде Игла (DMEM с 4,5 г / л глюкозы и 1-глутамина без пирувата натрия, Mediatech), дополненной 10% инактивированной энергией эмбриональной бычьей сыворотку (FBS) и гентамицин (50 мкг / мл).

Candida albicans, поддерживаемый при -80 ° C до использования, изначально субкультивировали на агаре Sabourad Decxtrose. Для использования C. albicans культивировали на среду Fungisel (37 ° C, 48 часов, Troy Biologics). Суспензии дрожжей (YF) готовили в растворе сбалансированных солей Хэнкса (HBSS, 105 КОЕ / мл конечной концентрации, 37 ° C) непосредственно перед использованием. Формы пробирки (GT) генерировали путем инкубации во фетальной бычьей сыворотке (FBS, 3 часа, 37 ° C, Abs600 0,3) с последующей промывкой в ​​HBSS (2 × 4000 × g) и повторной суспензией в HBSS до 105 КОЕ / мл конечной концентрации.

Staphylococcus aureus ATCC 25923, поддерживаемый при -80 ° C до использования, субкультивировали на среду солей маннита (37 ° C, 18 часов) для использования. Суспензии S. aureus готовили непосредственно перед использованием в HBSS (конечная концентрация 105 КОЕ / мл, 37 ° C).

Число клеток, связанных с клетками HeLa S. aureus и C. albicans, было определено как показатель инициации биопленки (приверженность). HeLa 229 выращивали в течение ночи в 96-луночном (4 × 104 клеток / лунку) при 37 ° С, 5% СО2 до достижения 85% конечного слияния. Перед заражением вирусом клетки промывали 1 × Opti-MEM с помощью HEPES, бикарбоната натрия и 1-глутамина (Gibco). Вирус (HSV-1 (KOS) gL86 или HSV-2 (KOS) 333gJ-) добавляли к клеткам HeLa 299 при множественности инфекции (MOI) 50 и 10 в течение 3 часов при 37 ° C, 5% CO2. После вирусной инфекции клетки промывали один раз PBS, затем HBSS, перед инкубацией с C. albicans YF или GT с и без S. aureus (соотношение 5: 1 к клетке, n = 16). После инкубации (30 мин, 37 ° С, 5% СО2) монослои клеток HeLa промывали для удаления несвязанных микробов (PBSx3) и лизировали (RIPA, Life Technologies, разбавление 1:50, стерилизуют фильтрованием). Лизат клеток (50 мкл) распределяли по маннитовым солям и / или агару Fungisel для отбора S. aureus и C. albicans соответственно. Контроль состоял из неинфицированных HSV клеток HeLa, обработанных, как описано для инфицированных вирусом клеток HeLa. Для каждого эксперимента проводилась отдельная контрольная пластина для подтверждения вирусного MOI.

Исследования изображений HSV-1- и HSV-2-инфицированных (MOI 50; 3 ч, 37 ° C) монослоев HeLa-клеток (5 × 104 клеток / покровное стекло) выполнялись как с помощью флуоресцентной микроскопии, так и с помощью светлой полевой микроскопии. Клетки-монослои инкубировали (30 мин, 37 ° С, 5% СО2) с S. aureus и C. albicans (5: 1 мишень в клетку). Затем клетки HeLa отмывались от неадгезивных микробов (PBSx3) и фиксировали (метанол). Для флуоресцентной микроскопии монослои окрашивали FITC-конъюгированным вирусом простого герпеса типа 1 + 2 gD-антитела (Abcam) и 4′-6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; Life Technologies), затем исследовали с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Клетки, которые были положительными по сигналу для ВПГ или Candida или S. aureus (100 отдельных клеток на каждый микрополосковый сигнал на покровное стекло), были вторично сканированы на наличие дополнительных сигналов совместной локализации микробов (начальное увеличение 1000 ×, Nikon). Для яркой полевой микроскопии клеточные монослои окрашивали кристаллическим фиолетом Грама (Troy Biologics), а затем исследовали с помощью световой микроскопии. Клетки, которые были положительными для Candida или S. aureus (100 отдельных клеток на каждый микрополосковый сигнал на покровное полотно), были вторично сканированы на наличие дополнительных сигналов соседней локализации микробов (начальное увеличение 1000 ×).

Каждый эксперимент по адгезии проводился дважды в окклю- сите. Каждое исследование изображений проводилось дважды в трех экземплярах. Данные оценивались с помощью анализа дисперсии (ANOVA, GraphPad InStat 3.10 для Windows, GraphPad Software Inc.). Средние значения были значительно различны при P

Поскольку HSV-1 и HSV-2 совместно локализуются в ротоглотке с C. albicans, мы сначала определили их эффект в одиночку и в согласии на приверженность S. aureus к инфицированным вирусом клеткам HeLa по сравнению с приверженностью S. aureus к вирусу свободных HeLa-клеток. И HSV-1-, и HSV-2-пораженные S. aureus прилипания к клеткам HeLa (рис.1a, b). При самой высокой концентрации вируса (MOI 50) уровень S. aureus, связанный с неинфицированными клетками HeLa (24,2 КОЕ / ч. ± 3,19; n = 16), был значительно выше (в 2,7 раза, P

Совместная инкубация S. aureus с формами зародышевой трубки C. albicans (GT) восстанавливала уровень приверженности S. aureus к клеткам HeLa, инфицированным HSV-1 и HSV-2, к измерению для неинфицированных контролей клеток HeLa. Подобно влиянию форм GT, связывание S. aureus с инфицированными HSV-2 клетками в присутствии дрожжевых форм C. albicans (YF) приводило к уровням стафилококковой адгезии, подобным уровням неинфицированных клеток HeLa. Напротив, присутствие YF не влияло на опосредованную HSV-1 депрессию при приверженности S. aureus. Эти результаты показывают, что вступление вируса HSV является антагонистом приверженности S. aureus, антагонизм, который частично может быть отменен C. albicans GT и YF.

В этих анализах мы определили, повлияли ли C. albicans GT и YF на клетки HeLa на ВПГ и S. aureus (рис.1c-f). Наши результаты показали, что HSV-1 и HSV-2 значительно (P

HSV-опосредованное усиление прилипания YF и GT было достоверно (P

Мы визуально исследовали ассоциацию S. aureus и C. albicans с HSV-1 и HSV-2-инфицированными клетками HeLa с использованием разностей размеров, морфологии и расположения S. aureus и C. albicans для различения организмов. В отсутствие HSV-1 или HSV-2 S. aureus и C. albicans (GT и YF) были локализованы на неинфицированных контрольных клетках HeLa (фиг.2а). Напротив, ко-локализация стафилококков с C. albicans не наблюдалась на клетках HeLa, инфицированных HSV-1 или HSV-2 (фиг.2b-d). Используя флуоресцентную микроскопию с FITC-конъюгированным моноклональным антителом против HSV-gD, мы также подтвердили, что S. aureus (фиг.3b, c) не локализуется с C. albicans, HSV-1 или HSV-2 (фиг.3a , a1, 3d). Однако Candida co-локализуется с HSV-1 и HSV-2 (фиг.3a1, c). S. aureus и C. albicans не наблюдались микроскопически, чтобы взаимодействовать друг с другом (данные не показаны). Кроме того, картина приверженности ко-локализации S. aureus и Candida, в отсутствие HSV, указывает на отсутствие физического вмешательства в приверженность друг друга. Эти данные также указывают на истощение доступных рецепторов присоединения S. aureus после входа в клетку HSV. 2 Отсутствие взаимодействия S. aureus и C. albicans на клетках HeLa, инфицированных HSV-1 и HSV-2. HSV-1 и HSV-2-инфицированные (MOI 50) HeLa-монослои с S. aureus и C. albicans (5: 1 мишень в клетку). Для яркой полевой микроскопии клеточные монослои окрашивали кристаллическим фиолетовым кристаллом Грама, затем исследовали с помощью световой микроскопии. Клетки, которые были положительными для Candida или S. aureus (100 отдельных клеток на каждый микробный сигнал / на покровное стекло) для, были вторично сканированы на наличие дополнительных сигналов совместной локализации микроорганизмов (начальное увеличение × 1000). а-a1
S. aureus (Sa) и C. albicans дрожжевые формы (YF) или зародышевые формы (GT) локализуются на неинфицированных клетках HeLa; a2 (вставка) Процент клеток HeLa с ко-локализованными или отдельными микробами; b-b3 Недостаточная локализация S. aureus и C. albicans в присутствии HSV-1; c-c2 Недостаточная локализация S. aureus и C. albicans в присутствии HSV-2; среднее значение ± SEM

Отсутствие совместной локализации S. aureus с C. albicans на HSV-1- или HSV-2-инфицированных клетках HeLa. HSV-инфицированные монослои клеток HeLa с заражением S. aureus и C. albicans (5: 1 мишень к клетке) (FITC-конъюгированное антитело против HSV gD и DAPI). Изображения представляют собой результаты скрининга клеток, которые были положительными для HSV, а затем сканировали на Candida и S. aureus (100 отдельных клеток на каждый микрополосковый сигнал на покровное полотно), которые затем были вторично сканированы на наличие дополнительных сигналов совместной локализации микробов (× 1000 начального увеличения, Nikon). а-a4
C. albicans (вставка a2, окрашивание DAPI) совместно локализуются с HSV-1; б-b3
C. albicans совместно локализованы с HSV-2 (вставка b1, окрашивание DAPI C. albicans); среднее значение ± SEM

В этом отчете мы описываем модельную систему in vitro для изучения полимикробных взаимодействий, которые происходят на стадии инициирования в образовании биопленки, то есть прилипания. Использование клеток HeLa в этой модельной системе представляет собой уникальное преимущество при изучении микробных взаимодействий в отношении рецепторов клеточной поверхности, поскольку им не хватает поверхностной экспрессии фибронектина [4, 13, 27]. Это отсутствие поверхностного фибронектина более точно имитируется, что наблюдается при колонизации и естественной инфекции, поскольку апикальная поверхность эпителия слизистой оболочки обычно не содержит фибронектина [18, 33, 38, 49, 66]. Это отсутствие фибронектина также позволяет изучать альтернативные механизмы, с помощью которых S. aureus и C. albicans прилипают к инфицированным HSV клеткам, поскольку оба микроба придерживаются фибронектина [2, 4, 13, 40, 69]. Эта модельная система для изучения влияния вируса на бактериальную и грибную приверженность была еще более усилена за счет использования навыков входа и репликации, но нераспространяющихся штаммов HSV-1 и HSV-2 [3, 74].

HSV проникает в клетки через эндоцитоз [56, 57]. Эндоцитоз вирусно-рецепторного комплекса приводит к динамическому проявлению рецепторов клеточной поверхности, доступным S. aureus и C. albicans для их приверженности. Интересно, что существует противоположное взаимодействие S. aureus и C. albicans с гепарансульфатами на поверхности клеток млекопитающих. S. aureus прилипание к различным сульфированным гепаранам, особенно гепаран-синдикан-1, имеет важное значение при его взаимодействии с эпителиальными клетками [31, 36, 42, 47, 61, 73]. Напротив, присутствие гепарансульфатов на поверхности клеток блокирует C. albicans прилипание к белкам внеклеточного матрикса, например, ламинину и коллагенам типов I и IV [43]. Ввод клеток HSV вызывает специфическое видовое (HSV-1 против HSV-2) дифференциальное истощение гепарансульфатов и индукцию секреции гепараназы, которая дополнительно разрушает сульфированные гепаранты поверхности клеток [1, 14, 20, 28, 30, 35, 41 , 45, 56, 57, 70, 75]. Оба эти события кажутся критичными в наших наблюдениях. Например, потеря рецепторов гепарансульфата S. aureus может объяснить отсутствие его прилипания к клеткам HeLa, инфицированным либо HSV-1, либо HSV-2 (фиг.4). Напротив, предпочтительные рецепторы Candida были бы разоблачены в результате производства гепараназы и истощения входа HSV поверхностных гепарансульфатов. Различие HSV-1 и HSV-2 от сульфированных гепаран-рецепторов может объяснить наши результаты усиленной приверженности к инфицированным вирусом клеткам, которые были зависимыми от Candida фенотипа (YF-GT) (рис.4) [45]. 4 Предлагаемая модель ключевых шагов, связанных с полимикробным взаимодействием (подробнее см. Текст). Sa
S. aureus, YF дрожжевая форма, форма зародышевой трубы GT, HS-гепарансульфат HS, вирус простого герпеса HSV, белки внеклеточного матрикса ECM, отличные от гликозаминогликанов, например ламинин и коллаген

Хотя эта модель начинает рассматривать образцы, измеренные для приверженности S. aureus и C. albicans к инфицированным HSV клеткам, вторичный механизм, вероятно, ответственен за влияние S. aureus и C. albicans на приверженность друг друга в присутствии обоих неинфицированных и инфицированных ВПГ (50% клеток HeLa, инфицированных / хорошо, MOI50). HSV-инфицированные клетки высвобождают интерфероны альфа и гамма, что, в свою очередь, вызывает возмущение липидных плотов, изменяющих текучесть мембраны (гидрофобность) и клеточный цитоскелетный комплекс в невинно инфицированных клетках [24, 34, 60, 64, 72]. Оба S. aureus и C. albicans взаимодействуют с гидрофобными поверхностями [2, 21, 32]. Вторичное внешнее HSV-опосредованное действие на неинфицированные клетки, то есть изменение поверхностной гидрофобности, может привести к увеличению приверженности S. aureus и C. albicans и явному восстановлению связывания клеток. Отсутствие клеточного распространения вируса в этой модельной системе позволит определить, какое изменение, связанное с вирусом, изменение клетки, т. Е. Внутренняя, внешняя или комбинация изменений, отвечает за дифференцированное соблюдение S. aureus и C. albicans [2, 21].

Находка здесь показывает, что HSV-1 и HSV-2 делают клетки резистентными к приверженности S. aureus, одновременно повышая приверженность фенотипическому специфическому C. albicans, а также склонность к дифференцированному прилипанию фенотипического гриба, опосредованному HSV-1 (дрожжевая форма) против HSV -2 (форма зародышевой трубки) начинают объяснять места колонизации хозяина и могут играть роль, направленную на поддержание кандидатурного комменсала (YF) по сравнению с патогенным состоянием (GT) in vivo, например, HSV-2 может влиять на частоту вагинального кандидоза. Эти положительные взаимодействия между HSV и C. albicans также могут обеспечить среду, более благоприятную для выживания ВПГ. Недавно было показано, что HSV-1 внедряется в грибную биопленку, где она остается жизнеспособной и защищена от противовирусных агентов, а также факторов хозяина, например антител [50]. Эта защита ВПГ от факторов хозяина дополняется способностью Candida понижать регуляцию провоспалительной цитокинов хозяина, что может нанести ущерб репликации HSV [17, 23, 26, 76]. Показано, что HSV-1, в свою очередь, защищает Candida за счет снижения уровня противогрибкового иммунного ответа [15]. И HSV, и Candida выиграют от исключения S. aureus из их окрестности. S. aureus — провоспалительный патоген [80]. В дополнение к индукции различных цитокинов, включая гамма-интерферон, хроническое присутствие S. aureus вызывает лейкоцитарный инфильтрат, включающий нейтрофилы, Т-клетки и естественные киллерные клетки [62, 78]. Такой провоспалительный ответ будет пагубным как для ВПГ, так и для выживаемости кандидатов.

Насколько нам известно, это первый отчет, демонстрирующий способность ВПГ регулировать приверженность множественным оппортунистическим патогенам, которые являются частью микробиома межцарства. Это исследование демонстрирует, что HSV-1 и HSV-2 модулируют как грибковую, так и бактериальную прилипание к клеткам, вероятно, частично, путем изменения HSV на поверхности поверхности гепарансульфата. Эти данные представляют собой сдвиг парадигмы с нынешним мнением о том, что факторы хозяина исключительно контролируют членов микробиома-популяции, к одному из которых латентный вирусный патоген в течение всей жизни может кооптировать хозяина определенным молекулярным механизмом, который изменяет инициирование биопленки, таким образом, узурпируя регуляторный контроль членства в микробиоме. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить специфическую роль различных рецепторов ВПГ-вируса в модуляции стафилококковой и кандидозной приверженности. Понимая начальные взаимодействия, происходящие между ВПГ-1 и ВПГ-2 в качестве постоянных членов микробиома-хозяина, и хроническими колонизаторами, например S. aureus и C. albicans, открывается другой путь в отношении ингибирования и элиминации биопленки.

Балбина Дж. Плоткин и Ира М. Сигар внесли одинаковый вклад в эту работу.

Вайбхав Тивари и Скотт Халькьярд внесли существенный вклад в эту работу.

Этот проект был поддержан исследовательскими фондами из Управления исследований и спонсируемых программ (ORSP), Университета Среднего Запада, Иллинойса и Колледжа стоматологической медицины — Иллинойса (CDMI) в Университете Среднего Запада.

У авторов нет конфликта интересов.