Вирусы простого герпеса культивируют

Вирус герпеса размножается во многих различных тканевых культуральных системах, в монослоях эпителиальных клеток почек кролика, обезьяны, амниона человека, куриного эмбриона. Он также размножается в клетках Hela и фибробластах куриного эмбриона и человека. Могут быть использованы и культуры роговицы кролика. Бляшки развиваются в монослоях куриного эмбриона, амниона человека и клеток Hela.

Цитопатогенное действие может проявляться на 2-3 день, но в зависимости от дозы вирус может обнаруживаться и после заражения через 8 ч, когда отдельные клетки начинают округляться и появляются гигантские клетки, содержащие 100 ядрышек. В этот период можно видеть внутриядерные включения. Мы отмечаем три основных проявления ЦПД: пролиферацию и увеличение клеток, округление клеток без пролиферации и формирование гигантских клеток. Нами описан штамм вируса герпеса, который образовывал гигантские клетки.

В первичной культуре почки кролика ЦПД наступает после 12 ч заражения в 30-50% клеток монослоя и полностью через 2 дня.

В первичной эмбриональной культуре клеток куриного эмбриона вирус герпеса генитального происхождения образует бляшки. Визуально бляшки наблюдаются после 2-го дня и имеют размер от 2 до 3 мм. Для того чтобы они были лучше видны и подсчитаны, их можно покрасить нейтральным красным.

Считают, что самое раннее проявление вируса герпеса на клетку заключается в задержке митозов, которая наступает после заражения; через 6 ч наблюдается увеличение ДНК в ядрах. Фаза эклипса, в течение которой отсутствует инфекционность, длится около 12 часов, и вирус выделяется в среду через 15 часов.

Нами был использован МФА в клетках Hela, зараженных вирусом простого герпеса. Мы обнаружили флюоресцирующие образования различной локализации (большие и малые гранулы в ядре, грануляция и диффузная флюоресценция в цитоплазме или около ядерной мембраны). Специфический вирусный антиген обнаруживался МФА, если титр инфекционного вируса в клетках достигал 102’5 1О3’°ТСД5О/О, мл. Было изучено образование инфекционного вируса и вирусного антигена на протяжении 6-15 пассажей в клетках Hela, хронически инфицированных вирусом герпеса. Хроническая инфекция поддерживалась культивированием инфицированных клеток в среде, содержащей 40% человеческой сыворотки со специфическими антигенами. Методом флюоресцирующих антител доказано наличие внутриклеточного вируса и вирусного антигена в инфицированных клетках. Внеклеточный вирус в культуральной жидкости не обнаруживался.

В противоположность активной вирусной инфекции вирусный антиген обнаруживался в хронически инфицированных клетках даже при очень низких титрах внутриклеточного вируса.

P. Sandra и соавторы была показана различная адсорбционная способность клонированных штаммов вируса герпеса, размножающихся (ch+) и не размножающихся (ch ) в клетках куриного эмбриона (КЭ). При одинаковой множественности заражения (100 БОЕ) через 15 мин адсорбировалось 36% ch+ вируса и 50% ch , через 2ч — соответственно 67 и 90%.

Образование вирусных антигенов обоих вирусов было одинаковым в клетках почки кролика, однако в клетках КЭ ch+ вирус образовывал антигены в 8 раз больше. Различий в локализации антигенов, по данным иммунофлюоресценции, не обнаружено.

Многими авторами была изучена чувствительность клеток WI-38, первичных эмбриональных фибробластов, почки эмбриона человека, а также Нер-2 к вирусу герпеса. После однократного заражения культуры поддерживали в течение длительного срока. Через 3 недели только в клетках WI-38 наблюдался ЦПД. Чувствительность этих клеток к вирусу увеличивалась после их обработки диэтиламино-этилдекстраном. В инфицированных клетках обнаруживался комплементсвязывающий антиген.

Кроме того, заражали вирусом простого герпеса ретиналь-ные культуры новорожденных кроликов. Как показали исследования, этот вирус вызывает характерные ядерные изменения в ретинальных культурах и деструкцию нейронов, что может быть использовано при селекции клеточной чувствительности и характеристики биологической особенности вируса герпеса.

Некоторые штаммы вируса герпеса вызывают острую лити-ческую инфекцию культур ткани, а другие размножаются на тех же культурах ткани, формируя синцитий. С понижением окружающей температуры с 37°С до 33°С удается трансформировать острую герпетическую инфекцию в хронический процесс.

Культивирование вируса герпеса можно проводить также на куриных эмбрионах, заражая их в амниотическую полость, желточный мешок, на хорионаллантоисную оболочку или непосредственно в сам эмбрион.

При заражении на хорионаллантоисную оболочку можно наблюдать микроскопические изменения, представляющие собой очаги пролиферации с центральными некротическими участками.

Для куриных эмбрионов первые пассажи вируса герпеса чаще всего не вызывают специфической гибели, а последующие являются летальными для куриного зародыша через 3-5 дней после заражения.

Специфические внутриядерные вирусные включения можно обнаружить во всех органах инфицированных куриных эмбрионов, что считается патогномоничным для этой инфекции.

J. Parker и соавторы, А.Ф. Пухнер наблюдали, что штаммы вируса герпеса генитального происхождения, изолированные от больных с герпетическими поражениями гениталий, продуцировали на хорионаллантоисной оболочке развивающихся куриных эмбрионов большие атипичные некротические поражения. Штаммы вируса герпеса, изолированные ими от пациентов с герпетическими поражениями экстрагенитальной локализации, продуцировали через 24 ч на хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов классические мелкие (1-2 мм) некротические участки поражения. Это может быть использовано для дифференциации штаммов вируса герпеса генитального и экстрагенитального происхождения, так как по морфологическим изменениям в культуре ткани и по ЦПД это сделать не удается .

После первичных цитологических находок в соскобах клеток, взятых у лиц с герпесом, вирус может быть изолирован в 43% случаев, при повторных цитологических находках — в 18% случаев, т.е. как в первые 10 дней после начальных цитологических изменений, так и после 20 дней заболевания герпесом.

W. Ashe и соавторы сообщили об изоляции вируса герпеса симплекс из слюнной железы людей.

У куриных эмбрионов, зараженных на хорионаллантоисную оболочку вирусом герпеса, вирусемия наблюдается в первые сутки после заражения и держится на высоком уровне вплоть до гибели куриного зародыша. Было показано, что при острой герпетической инфекции у куриных эмбрионов во время вирусе-мии вирус связан с эритроцитами с разной интенсивностью.

По данным P.M. Бикбулатова (1986), наибольшей цитомор-фологической чувствительностью к заражению ВПГ обладали из первичных культур ФЭЧ, ПЭЧ, из перевиваемых Vero, СОЦ.

Это может иметь определенное значение и для цитодиагностики ВПГ с использованием клеточных культур.

Им установлено, что ВПГ-инфекция клеточных культур сопровождается выраженными изменениями метаболизма клеток: активизацией окислительно-восстановительных митохондриаль-ных ферментов, увеличением энзимов белкового и углеводного обменов, выходом из клеток лизосомальных гидролитических ферментов и индукцией патологических митозов. Это позволяет думать, что с самых ранних этапов ВПГ-инфекции митохон-дриальный аппарат клетки активно реагирует на воздействие вируса и обеспечивает его энергией для проникновения и последующего биосинтеза.

В.Я. Кицаком (1984) приведено исследование этиологической и патогенетической роли ВПГ-2 в канцерогенезе. Показана трансформирующая активность вируса в культуре клеток, си-нергическое влияние персистентной герпетической инфекции на химический канцерогенез у мышей, усиление коканцероген-ного эффекта ВПГ-инфекции на химический бластогенез в условиях интоксикации организма животных, а также этиопатоге-нетическая связь герпеса гениталий с раком шейки матки человека. Им также установлена способность ВПГ-2 индуцировать трансформацию клеток хомячка, которая фенотипически проявляется в изменении совокупности функциональных морфологических свойств. Этот автор показал, что неопластическая трансформация клеток под влиянием ВПГ-2 является многоэтапным процессом и что молекулярно-генетический механизм индукции трансформации клеток связан с прямым онкогенным действием ВПГ-2.

Изоляция вируса герпеса производится на кроликах, мышах-сосунках, в культурах тканей и в куриных эмбрионах. Кроликов заражают интрацеребрально или в роговицу глаза. Мышей-сосунков заражают интрацеребральным путем, а куриные эмбрионы — в хорионаллантоисную оболочку. Наряду с этим производят инокуляцию вируса герпеса в культуры ткани, чувствительные к этой инфекции, включая ткань роговицы и клетки почки кролика, амнион человека или клетки Hela. Вирус герпеса вызывает в них цитопатические изменения — появление гигантских клеток с внутриядерными включениями. В противоположность этому вирусы герпеса Zoster и ветрянки не способны вызывать инфекционный процесс у белых мышей-сосунков, кроликов, на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона и в клетках роговицы кролика.

Частота выделения вируса герпеса из гениталий больных зависит в определенной степени от использования различных методов изоляции вируса и колебалась, по нашим данным, от 70 до 95,4% случаев.

Для идентификации вируса герпеса применяется ряд серологических реакций. Наиболее широко используются реакции нейтрализации и реакция связывания комплемента (РСК). Кровь берут от пациентов в первые дни заболевания, дают свернуться и отделяют сыворотку. Повторно кровь для получения сыворотки берут через 2-3 нед, т.е. в период выздоровления. Если нельзя сразу исследовать сыворотку, то ее хранят в холодильнике при температуре -20°С.

Koзлoвa В.И., Пyxнep А.Ф.

Герпетическая инфекция, подробнее…

Дополнительная информация:

• Лабораторная диагностика герпеса
• Реакция нейтрализации вируса герпеса на белых мышах
• Вся информация по этому вопросу